保定地區(qū)羊源致病性糞腸球菌的分離鑒定及其毒力性與耐藥性分析

林倩穎,侯銘源,賈 麗,楊 明,武英豪,李連敏,袁麗寧,馬玉忠*,楊 威

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河北 保定 071000; 2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所,河北 保定 071000)

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)是一種兼性厭氧的革蘭陽(yáng)性球菌,廣泛存在于自然界,是人和動(dòng)物胃腸道內(nèi)定植的機(jī)會(huì)致病菌[1]。然而,根據(jù)近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),人和動(dòng)物感染糞腸球菌的病例不斷增加,在感染革蘭陽(yáng)性菌的病例中,感染率僅次于葡萄球菌[2]。尿路感染、敗血癥、心內(nèi)膜炎等與糞腸球菌感染密切相關(guān)[3]。

近年來(lái),抗生素在獸醫(yī)臨床與畜牧養(yǎng)殖上的廣泛使用導(dǎo)致動(dòng)物源性糞腸球菌的耐藥性增強(qiáng),感染率上升,為畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)擬通過(guò)采集保定地區(qū)患有肺炎、腹瀉羊的樣本,對(duì)其進(jìn)行藥敏試驗(yàn)、致病性試驗(yàn)、毒力基因檢測(cè)、耐藥基因檢測(cè),探究河北保定地區(qū)羊源致病性糞腸球菌的毒力性與耐藥性,為該病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料KF鏈球菌瓊脂購(gòu)自青島海博公司;LB肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基購(gòu)自北京奧博星公司;藥敏片為杭州濱和微生物試劑公司生產(chǎn);2×Taq PCR MasterMix、DNA Marker購(gòu)自北京天根公司;16S rRNA基因通用引物、糞腸球菌毒力基因引物、耐藥基因引物由生工生物工程(上海)公司合成。6～7周齡SPF級(jí)BALB/c小鼠,雌、雄各1/2,體質(zhì)量20～24 g,購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 病料來(lái)源從保定地區(qū)選取同時(shí)發(fā)生肺炎和腹瀉的病羊30只,對(duì)病羊進(jìn)行解剖和觀察病變組織,對(duì)病變組織拍照記錄并分析,取病羊肝臟、肺臟等病變組織,進(jìn)行病原的分離鑒定。

1.3 細(xì)菌的分離純化將采集好的病變組織涂抹至營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上,37℃ 恒溫培養(yǎng)24 h。挑取灰白色、針尖大小的圓形菌落,接種于LB肉湯中,37℃振蕩培養(yǎng)12 h,將菌液均勻涂布至KF鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,選擇深紅色圓形菌落純化培養(yǎng),隨后革蘭染色,鏡檢。

1.4 溶血性試驗(yàn)將純化后的菌株接種至含有5%無(wú)菌綿羊血的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上,37℃恒溫培養(yǎng)24 h,觀察其是否溶血,在5%綿羊血培養(yǎng)基上如有直徑1 mm左右圓形灰白色菌落,且呈現(xiàn)β溶血,可初步判斷為糞腸球菌。

1.5 16S rRNA鑒定采用水煮法提取細(xì)菌DNA作為模板,并用16S rRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物交由生工生物工程(上海)公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在NCBI上BLAST比對(duì)。陽(yáng)性菌株以菌液和滅菌甘油水1∶1 比例置于-20℃ 保存。

1.6 藥敏試驗(yàn)采用K-B紙片擴(kuò)散法,根據(jù)2018年美國(guó)臨床委員會(huì)(CLSI)推薦的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn),對(duì)所分離出的糞腸球菌進(jìn)行13種常見藥物的耐藥性測(cè)定。

1.7 致病性試驗(yàn)將分離純化后的糞腸球菌接種至LB肉湯,37℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜,參考文獻(xiàn)[4]將菌液濃度調(diào)整至1.0×108CFU/mL。將90只小鼠隨機(jī)分為18組,每組5只,1組為對(duì)照組,其余17組為試驗(yàn)組。試驗(yàn)組小鼠分別腹腔注射0.2 mL菌液,對(duì)照組小鼠注射等量LB肉湯培養(yǎng)基,觀察其發(fā)病與死亡情況。剖檢死亡小鼠,記錄其病理剖檢變化。

1.8 毒力基因檢測(cè)采用PCR方法檢測(cè)膠原蛋白黏附素(ace)、表面蛋白(esp)、溶血素(cyl)、糞腸球菌心內(nèi)膜炎抗原(efaA)、蛋白明膠酶(gelE)、透明質(zhì)酸酶(hyl)、聚合物質(zhì)(asa1)等7種毒力基因。引物設(shè)計(jì)與退火溫度參照文獻(xiàn)[5-6],引物信息見表1。以待檢菌株DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,將PCR產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)。

表1 糞腸球菌毒力基因引物序列

1.9 耐藥基因檢測(cè)為檢測(cè)分離菌的耐藥基因攜帶情況,參考文獻(xiàn)[7-8]設(shè)計(jì)四環(huán)素類耐藥基因tetM、tetA,氨基糖苷類耐藥基因aac(6′)、aph(2″)-Ⅰ、aph(3′)-Ⅲa、ant(6)-Ⅰ,萬(wàn)古霉素類耐藥基因vanM,大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermB,β-內(nèi)酰胺類耐藥基因TEM的引物,引物信息見表2。對(duì)目的菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)。

表2 糞腸球菌耐藥基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 病羊的病理剖檢變化剖檢病羊,觀察其組織器官病理變化,發(fā)現(xiàn)肺部淤血,呈暗紅色,表面有大量纖維素性滲出物,觸摸失去正常肺臟組織應(yīng)有的彈性(圖1);心臟壁變軟;膽囊腫脹,充滿膽汁(圖2);腎臟質(zhì)地變軟(圖3);皺胃黏膜出血,幽門部出血腫脹(圖4);盲腸出血,黏膜脫落。

2.2 細(xì)菌的分離純化與形態(tài)學(xué)觀察分離出的細(xì)菌在綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出表面光滑、圓形凸起、邊緣整齊、針尖大小的半透明菌落,呈β溶血,有溶血環(huán)(圖5)。革蘭染色鏡檢,油鏡下可見大量藍(lán)紫色球菌(圖6)。在KF 鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出紅色點(diǎn)狀菌落(圖7)。

2.3 16S rRNA鑒定以待測(cè)菌株DNA為模板,并用16S rRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物交由生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在NCBI上BLAST比對(duì),17株分離株與糞腸球菌的同源性為98%～99%,確定為糞腸球菌(圖8)。

圖1 肺部纖維素性滲出

圖2 膽囊腫脹

圖3 腎臟質(zhì)地變軟

圖4 皺胃黏膜出血

圖5 血平板上菌落形態(tài)

圖7 KF鏈球菌瓊脂平板上菌落形態(tài)

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對(duì)照;2～11.被檢菌株

2.4 藥敏試驗(yàn)?zāi)退幥闆r見表3,17株糞腸球菌對(duì)阿奇霉素、紅霉素、慶大霉素、克林霉素4種藥物的耐藥率為100.00%。對(duì)氧氟沙星、萬(wàn)古霉素、四環(huán)素、利福平的耐藥率較高,分別為88.24%,82.35%,64.71%和58.82%。對(duì)青霉素G耐藥率較低為0.00%。

表3 糞腸球菌耐藥率

2.5 致病性試驗(yàn)試驗(yàn)組小鼠注射菌液24 h內(nèi)出現(xiàn)精神萎靡、行動(dòng)遲緩、進(jìn)食量減少等表現(xiàn),注射24 h 后開始出現(xiàn)死亡,72 h后試驗(yàn)組小鼠全部死亡。對(duì)照組小鼠未出現(xiàn)臨床癥狀。將死亡小鼠剖檢后發(fā)現(xiàn)(圖9),肝臟(圖10a)、脾臟(圖10c)腫大,脾臟表面有壞死灶,肺臟(圖10e)淤血,呈暗紅色,盲腸(圖10f)表面有出血點(diǎn)。死亡小鼠剖檢結(jié)果與病羊病理剖檢特點(diǎn)吻合,表明糞腸球菌感染可能是引起病羊發(fā)生肺炎、腹瀉的原因。

圖9 攻毒組小鼠剖檢圖

2.6 毒力基因共檢出6種毒力基因(表4,圖11～14),其中ace基因檢出率最高為100.00%。未檢出hyl基因。其中大多數(shù)菌株同時(shí)存在2種及以上毒力基因。

a.肝臟;b.心臟;c.脾臟;d.腎臟;e.肺臟;f.盲腸

M. DL2000 DNA Marker;1.陰性對(duì)照;2～5.被檢菌株

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對(duì)照;2～5.被檢菌株

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對(duì)照;2～5.被檢菌株

M. DL2000 DNA Marker;1.陰性對(duì)照;2～5.被檢菌株

表4 糞腸球菌毒力基因的檢測(cè)

2.7 耐藥基因共檢出5種耐藥基因(表5,圖16～18),大環(huán)內(nèi)酯類ermB基因(圖18)檢出率最高,為100%,β-內(nèi)酰胺類的耐藥基因未檢出。

表5 糞腸球菌耐藥基因的檢測(cè)

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對(duì)照;2～5.被檢菌株

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對(duì)照;2～5.被檢菌株

M.DL2000 DNA Marker ;1.陰性對(duì)照;2～5.被檢菌株

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對(duì)照;2～5.被檢菌株

3 討論

糞腸球菌作為人和動(dòng)物體內(nèi)的正常菌群發(fā)揮著重要的作用。近年來(lái),糞腸球菌作為一種條件致病菌感染的病例越來(lái)越多,對(duì)人體健康和畜牧養(yǎng)殖都造成了嚴(yán)重的危害。研究表明,糞腸球菌與尿路感染、乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎、腦膜炎、感染性心內(nèi)膜炎等多重疾病的發(fā)生相關(guān)[9-10],而糞腸球菌與呼吸系統(tǒng)疾病的關(guān)系報(bào)道較少。探究羊源致病性糞腸球菌的毒力性與耐藥性,對(duì)于指導(dǎo)對(duì)羊肺炎和腹瀉等疾病的用藥,控制該病的傳播具有重要意義。

本研究對(duì)河北保定地區(qū)發(fā)生肺炎和腹瀉的30只病羊進(jìn)行剖檢,并對(duì)病變組織進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定,共分離出17株糞腸球菌。將分離到的菌株接種到綿羊血瓊脂平板上,呈β溶血,證明分離到的糞腸球菌具有致病性,可以引起羊的敗血癥與菌血癥[11]。將分離到的菌株接種到小鼠體內(nèi),小鼠24 h內(nèi)出現(xiàn)臨床癥狀,72 h后全部死亡,說(shuō)明分離到的糞腸球菌具有致病性。剖檢死亡小鼠可以發(fā)現(xiàn),肺部淤血,盲腸出血等癥狀,與病羊剖檢癥狀相吻合,表明糞腸球菌感染可能是引起病羊發(fā)生肺炎、腹瀉的原因。

本研究采用分子生物學(xué)的方法,對(duì)17株致病性糞腸球菌進(jìn)行了7種常見的糞腸球菌毒力基因的檢測(cè),均檢出了ace基因;此外,esp基因、gelE基因和efaA基因檢出率較高,與CRETI等[12]的檢測(cè)結(jié)果相似。ace基因?yàn)槟z原蛋白黏附素,在糞腸球菌感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中有輔助糞腸球菌黏附在宿主細(xì)胞表面并完成定殖的作用;efaA基因也是糞腸球菌的一種表面黏附蛋白;esp基因可以參與細(xì)胞壁的合成,有促進(jìn)細(xì)菌黏附的作用;gelE基因與糞腸球菌生物膜的形成有關(guān),可編碼產(chǎn)生活性肽和自溶素,加速細(xì)菌的繁殖與擴(kuò)散[13]。本試驗(yàn)中糞腸球菌編碼黏附力的基因較多,細(xì)菌可能是由于較強(qiáng)的黏附性對(duì)機(jī)體造成的損傷;且具有能夠介導(dǎo)產(chǎn)生自溶素的基因,能使宿主細(xì)胞加速裂解,促進(jìn)病原菌在宿主體內(nèi)擴(kuò)散,這可能與糞腸球菌的致病性相關(guān),這與黃奕雯等[14]的觀點(diǎn)相似。本試驗(yàn)檢出較多菌株同時(shí)含有多個(gè)毒力基因,因此糞腸球菌的致病過(guò)程可能與多種毒力基因共同作用有關(guān),這與王亞賓等[15]的研究結(jié)果相似。在致病性試驗(yàn)中,試驗(yàn)組小鼠被致病性糞腸球菌感染死亡,但存活時(shí)間均有差異,可能與不同致病性糞腸球菌菌株攜帶的毒力基因種類不同相關(guān)。

為探究分離株的耐藥性,本研究對(duì)其進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)和耐藥基因的檢測(cè)。在13種常見藥物中,氨芐西林、阿莫西林、青霉素G等3種β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥率較低;在耐藥基因檢測(cè)中,β-內(nèi)酰胺類的耐藥基因未檢出。因此,在致病性糞腸球菌感染的病例治療過(guò)程中,可以優(yōu)先使用氨芐西林、阿莫西林、青霉素G等β-內(nèi)酰胺類藥物進(jìn)行治療。在本試驗(yàn)中,大多數(shù)藥物的耐藥率與其對(duì)應(yīng)種類藥物的耐藥基因檢出率相似或一致,如萬(wàn)古霉素的耐藥率與萬(wàn)古霉素類vanM基因的檢出率相同,均為82.35%;但也有個(gè)別藥物耐藥率與其對(duì)應(yīng)耐藥基因的檢出率的差異較明顯,如四環(huán)素的耐藥率和tetM基因的檢出率差異較大,分別為64.71%和35.29%。說(shuō)明耐藥基因可以反映糞腸球菌的耐藥程度,但也可能會(huì)存在耐藥表型與耐藥基因不匹配的問(wèn)題,造成差異的原因可能是耐藥基因未表達(dá)或存在其他耐藥機(jī)制,與鐘銳等[7]的試驗(yàn)結(jié)果相似。通過(guò)藥敏試驗(yàn)和耐藥基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn),糞腸球菌對(duì)阿奇霉素和紅霉素的耐藥性較強(qiáng),且大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermB的檢出率較高,可能由于大環(huán)內(nèi)酯類藥物的濫用和養(yǎng)殖人員盲目用藥有關(guān),及時(shí)對(duì)疑似感染致病性糞腸球菌的病例進(jìn)行病原菌分離鑒定與藥敏試驗(yàn)對(duì)阻斷糞腸球菌的進(jìn)一步感染具有重要意義。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)肺炎與腹瀉的病羊進(jìn)行了糞腸球菌分離鑒定試驗(yàn),分析了保定地區(qū)羊源致病性糞腸球菌的毒力性與耐藥情況,為羊源致病性糞腸球菌的診斷和治療提供了依據(jù)。