雞傳染性支氣管炎病毒抗體間接ELISA檢測方法的建立與初步應用

趙 佳,郭夢嬌,,張成成,薄宗義,楚電峰,曹永忠,吳艷濤,,張小榮,*

(1.揚州大學 獸醫學院 江蘇省動物重要疫病預防控制協同創新中心,江蘇 揚州 225009;2.動物基因工程疫苗國家重點實驗室,山東 青島 266114;3.揚州大學 農業科技發展研究院教育部農業與農產品安全國際合作聯合實驗室,江蘇 揚州 225009)

雞傳染性支氣管炎(infectious bronchitis,IB)是由傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)引起雞的急性、高度接觸性傳染病[1],臨床上主要以呼吸道損傷和間質性腎炎,母雞早期感染后呈現生殖系統不可逆的損傷,形成所謂的“假母雞”[2]。我國目前同時存在多個基因型IBV流行,并且新的型還在不斷出現[3-5],使得IB的流行情況日益復雜。

ELISA廣泛用于各種病原微生物感染的監測,具有成本低、易于操作以及能對群體進行診斷的優勢。對于IB而言,疫苗免疫和野毒感染后的抗體應答水平存在較大差異,野毒感染產生的抗體水平通常要遠遠高于疫苗免疫。針對特定的養殖場,在免疫程序相對固定的情況下,雞群免疫后不同時間點的抗體“基線”水平基本一致,如果在監測中發現某個時間點出現抗體水平異常升高且離散度增大的情況,一般即可判定該雞群可能發生了野毒感染。

N蛋白是構成IBV病毒粒子最主要的結構蛋白,在不同血清型的IBV中相對比較保守,在IBV感染后,機體產生針對N蛋白的特異性抗體相對于其他結構蛋白出現時間更早[6],對于監測野毒的早期感染具有重要意義。本試驗旨在以大腸桿菌原核表達的IBV N蛋白作為包被抗原,建立一種在固定血清稀釋倍數下對IBV抗體終點滴度進行定量檢測的間接ELISA方法,可應用于臨床IBV感染監測。

1 材料與方法

1.1 材料表達IBV N蛋白的菌株BL21(DE3)/pET-N、QX型IBV弱毒疫苗株QXL87和強毒株QXL均由本實驗室保存[7];SPF雞購自濟南斯派福瑞禽業科技有限公司;SPF雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司;不同時間采集的商品雞血清樣品由江蘇康瑞生態農業有限公司提供;SPF雞血清由國藥集團揚州威克生物工程有限公司提供;新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、H5、H7、H9亞型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)陽性血清由青島易邦生物工程有限公司提供;雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum,MG)、滑液囊支原體(Mycoplasmasynoviae,MS)、副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum,Apg)陽性血清由本實驗室制備并保存。

1.2 主要試劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自上海生工生物工程有限公司;Ni-NTA親和層析介質購自南京金斯瑞生物科技有限公司;IBV抗體檢測試劑盒購自IDEXX公司;脫脂奶粉購自Biofroxx公司;牛血清白蛋白(BSA)購自上海雙洳生物有限公司;魚明膠、Tween-20購自Sigma公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記兔抗雞IgG購自Thermo Fisher公司;TMB雙組分顯色液購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.3 IBV N蛋白的表達與純化按照文獻[7]方法對IBV的N蛋白進行原核表達并使用Ni-NTA親和層析法純化,通過SDS-PAGE鑒定純化效果,使用Image J軟件進行灰度分析。

1.4 陰、陽性血清的制備及效價測定16只25日齡的SPF雞飼養于負壓隔離器,免疫前翅靜脈采血分離血清,作為陰性對照血清。首次免疫用QXL87弱毒疫苗株進行滴鼻,之后每隔2周用QXL強毒株經滴鼻途徑攻毒,劑量均為105.0EID50/0.1 mL,第3次攻毒1周后,通過病毒微量中和試驗測定血清效價[8],效價達標后(NI50達到4.50～7.00)心臟采血,分離血清作為陽性對照血清。

1.5 ELISA技術參數的優化

1.5.1抗原包被濃度及血清稀釋倍數的確定 通過棋盤滴定法[9]確定抗原的最佳包被濃度及血清樣品的稀釋倍數,用碳酸鹽緩沖液(pH=9.60)將純化的重組蛋白的質量濃度從4.000 g/L倍比稀釋至3.125×10-2g/L,將IBV陰性、陽性血清分別進行1∶125～1∶4 000倍比稀釋,進行間接ELISA,讀取D450 nm值,通過P/N值來確定抗原最佳包被濃度與血清最佳稀釋倍數。

1.5.2酶標板封閉條件的確定 分別以質量分數為1.00% BSA-PBST、1.00% 魚明膠-PBST及5.00% 脫脂奶粉-PBST作為封閉液,并設置2,3和4 h的封閉時間,設置3個重復,進行間接ELISA,讀取D450 nm值,通過P/N值確定最佳封閉條件。

1.5.3抗體稀釋液的選擇 分別以PBST、質量分數為0.25%,0.50%和1.00% BSA-PBST作為抗體稀釋液,設置3個重復,進行間接ELISA,讀取D450 nm值,通過P/N值確定最佳抗體稀釋液。

1.5.4血清樣品孵育時間的確定 分別設置30,60和90 min作為血清樣品稀釋后的孵育時間,設置3個重復,進行間接ELISA,讀取D450 nm值,通過P/N值確定血清樣品的孵育時間。

1.5.5酶標抗體工作條件的確定 分別對酶標抗體進行1∶5 000,1∶10 000,1∶15 000,1∶20 000倍稀釋,設置30,60和90 min的孵育時間,設置3個重復,進行間接ELISA,讀取D450 nm值,通過P/N值確定酶標抗體的最佳反應條件。

1.5.6顯色時間的確定 分別設置10,15和20 min 3個顯色時間,設置3個重復,進行間接ELISA,讀取D450 nm值,通過P/N值確定TMB最佳顯色時間。

1.5.8特異性試驗 分別以IBV、AIV(H5、H7、H9)、NDV、MS、MG、Apg的單因子陽性血清及SPF雞血清作為測試樣品,每份血清設置3個重復,進行間接ELISA,以檢測該方法的特異性。

統計血清樣品在不同稀釋倍數下的D450 nm平均值,與PNT基線交點的最大稀釋倍數定義為該血清樣品的抗體ET。從中選取12份低滴度(ET ≤ 1 000)、19份中滴度(1 000 4 000)共50份血清樣品,使用GraphPad Prism 8.0軟件求解其最佳稀釋倍數處S/P值與ET的線性回歸方程,以此方程來預測血清樣品的ET,建立的檢測IBV抗體滴度的ELISA方法命名為IBVN-ELISA。

表1 Y03與Y04雞群免疫程序

2 結果

2.1 IBV N蛋白的表達與純化對IBV N蛋白進行了原核表達和純化,通過SDS-PAGE分析蛋白純化情況,與文獻[7]描述的純化結果相符,灰度分析顯示重組蛋白的純度達到86.37%,定量分裝后-70℃ 保存備用。

2.2 陽性血清的制備及效價測定經病毒微量中和試驗測定,制備的陽性血清中和抗體效價為:NI50=11.80。

2.3 ELISA技術參數的確定經過條件優化,通過P/N最大值確定了最佳反應條件,最終確定抗原包被質量濃度為0.50 g/L,4℃包被過夜,次日棄去孔中液體,PBST洗滌4次并拍干;用質量分數為5.00% 的脫脂奶粉-PBST在37℃條件下封閉2 h,棄去孔中液體,PBST洗滌4次并拍干;用質量分數為0.50%的BSA-PBST抗體稀釋液對血清樣品進行1∶500倍稀釋后37℃孵育30 min,棄去孔中液體,PBST洗滌4次并拍干;酶標抗體進行1∶5 000倍稀釋后37℃孵育30 min,棄去孔中液體,PBST洗滌4次并拍干;TMB避光顯色20 min,加入濃度為2 mol/L濃硫酸終止顯色,立刻讀取D450 nm值。

2.5 特異性試驗對IBV、NDV、AIV(H5、H7、H9)、MS、MG、Apg單因子陽性血清及SPF血清進行間接ELISA檢測,除IBV陽性血清外,其他血清的S/P值均低于臨界值0.385,說明建立的方法與其他陽性血清無交叉反應,具有良好的特異性。

2.6 重復性試驗批內和批間重復性試驗結果見表2,批內變異系數為0.740%～2.850%,批間變異系數為4.382%～6.769%。變異系數均低于10.000%,說明具有較好的重復性。

2.7 計算IBV抗體ET方程的建立選取50份通過PNT基線確定了抗體ET的血清樣品,通過軟件分析得出血清1∶500稀釋倍數處S/P值與抗體ET的線性回歸方程:log(ET)= 1.222 × log(S/P)+3.285,結果見圖1,相關系數(R2)達到0.959 3(P<0.000 1)。

2.8 符合性試驗

2.8.1陰、陽性符合率驗證 檢測了2個雞群共461份不同日齡商品雞的血清樣品,統計2種ELISA方法的檢測結果,如表3所示,與IDEXX試劑盒相比,IBVN-ELISA方法的總體樣品檢測符合率為93.06%,陽性檢測符合率為98.45%,陰性檢測符合率為64.86%。IDEXX試劑盒檢測為陰性,IBVN-ELISA檢測為陽性的26份血清均在14,21和28日齡,PNT基線法測定的結果均為IBV抗體陽性,滴度范圍為1 000～4 000。

表2 批內和批間重復性結果

圖1 ET與S/P值(1∶500稀釋倍數處)的線性回歸方程

表3 陰性、陽性符合率驗證

2.8.2抗體ET的消漲趨勢比較 分別計算在不同日齡時Y03和Y04 2個雞群的平均抗體ET并繪制折線圖,如圖2所示,2種ELISA方法檢測的抗體ET消漲趨勢保持一致。

2.8.3抗體ET分布情況比較 統計2種ELISA方法測得的陰、陽性血清的抗體ET,并繪制抗體ET分布散點圖,如圖3所示,IBVN-ELISA方法與IDEXX試劑盒測試的抗體ET分布情況基本相似。

2.8.4敏感性與特異性比較 通過ROC曲線分析2種ELISA方法的敏感性和特異性,如圖4所示,曲線下面積(AUC)為0.999 6,IBVN-ELISA方法的特異性達到100.00%,敏感性達到99.75%(P<0.000 1),與IDEXX試劑盒的檢測結果高度一致。

A.Y03雞群抗體ET消漲趨勢;B.Y04雞群抗體ET消漲趨勢

A.IDEXX-ELISA抗體ET分布圖;B.IBVN-ELISA抗體ET分布圖

A.IDEXX-ELISA敏感性與特異性分析;B.IBVN-ELISA敏感性與特異性分析

3 討論

我國是家禽養殖和消費大國,肉雞和蛋雞養殖規模增長迅速,雞群進行疫苗接種依然是防控IB最有效的措施,然而IBV極易發生重組和突變[11],變異毒株經常在接種疫苗的雞群中暴發感染,導致免疫失敗。因此越早地監測到野毒傳播,就可以盡快采取措施,及時降低經濟損失。尤其對于蛋雞而言,及早發現野毒感染,能減小“假母雞”帶來的負面影響。目前國內使用的IBV抗體檢測ELISA試劑盒基本都是進口產品,價格比較昂貴,檢測成本較高。大多數市售的ELISA試劑盒以IBV全病毒作為包被抗原[12],由于IBV的高度易變性, 包被全病毒抗原的試劑盒對于不同血清型野毒感染產生的抗體水平,測定結果可能存在一定的差異。但是不同血清型IBV的N蛋白較為保守,具有良好的免疫原性,針對不同血清型IBV感染后的抗體檢測結果更加穩定[13]。

本研究以原核表達的IBV N蛋白作為包被抗原,建立了檢測IBV抗體ET的ELISA方法。批內和批間變異系數均小于10.00%,具有良好的重復性;包被抗原與常見病原的陽性血清無交叉反應,具有較好的特異性;使用IDEXX試劑盒與本研究建立的IBVN-ELISA對2個不同品種雞群每隔1周進行連續抗體監測,結果表明2種方法檢測抗體ET的消漲趨勢保持一致,抗體ET的分布情況基本吻合;IBVN-ELISA的陽性符合率達到98.45%,陰性符合率為64.86%,其中26份IDEXX試劑盒檢測為陰性,IBVN-ELISA檢測為陽性的血清樣品均在14,21和28日齡,PNT基線法測定的結果均為IBV抗體陽性,與IBVN-ELISA的檢測結果一致,表明IBVN-ELISA能夠更靈敏的檢測到IBV特異性抗體;從方法的敏感性和特異性來看,IBVN-ELISA具有較高的特異性(100.00%)和敏感性(99.75%),且敏感性略高于IDEXX試劑盒。

不同的免疫程序及雞群品種的不同是IBV抗體ET及其消漲趨勢存在差異的主要原因[14]。此次監測了2個免疫程序相同但品種不同的雞群,結果表明:2個雞群的抗體ET值及其消漲趨勢并不完全相同,1日齡時2個雞群均以母源抗體為主,抗體ET最高,之后不斷下降。Y03雞群的抗體ET在21日齡時開始升高,在35日齡時達到峰值;而Y04雞群的抗體ET在14日齡時開始上升,ET峰值出現在42日齡。通過IBVN-ELISA監測不同品種雞群抗體ET及其消漲的規律并建立其抗體ET的基線在后續的研究計劃中將是很有意義的工作。

綜上所述,本研究建立的ELISA方法研制成本較低,穩定性良好,特異性及靈敏度較高,有著較好的檢測效果,能夠為養殖場在雞群抗體監測過程中發揮有效的檢測效力,為有效防控IB提供了技術支撐,具有良好的應用前景。