豬流行性腹瀉病毒纖突蛋白受體結合區(PEDV-RBD)重組蛋白的免疫原性

伊立超,郝嘉翼,鄒萬成,李樂天,姜宇航,張 爽,婁安鋼,李 昌*,金寧一*

(1.延邊大學 農學院,吉林 延吉 133000;2.中國農業科學院 長春獸醫研究所,吉林 長春 130122;3.吉林農業大學 動物科技學院/動物醫學院,吉林 長春 130118)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是尼多病毒目(Nidoviridae)、冠狀病毒科(Coronaviridae)的α冠狀病毒屬成員,能夠引起新生仔豬急性腹瀉、嘔吐、脫水甚至死亡。PEDV表面具有1個18～23 nm纖突的囊膜結構,纖突呈花瓣狀,由核心向四周呈放射狀分布,纖突末端呈球狀;病毒直徑為95～190 nm,是一種單股正鏈、不分節段RNA病毒。PEDV基因組大小約為28 kb,含有7個開放閱讀框,分別編碼大小為150 ～ 220 kDa的病毒纖突糖蛋白(S)、20～30 kDa的基質蛋白(M)、7 kDa的主要嵌膜蛋白(E)、58 kDa的核衣殼蛋白(N)與其他蛋白。病毒表面的纖突蛋白(spike,S)具有介導細胞附著和膜融合的作用[1]。某些哺乳動物冠狀病毒的S蛋白能被相關的蛋白酶切割成S1和S2;S1具有受體結合位點,S2具有融合活性。S1區內318～510氨基酸殘基可與ACE2[2-4]的肽酶域緊密結合。該片段為受體結合區(receptor-binding domain,RBD),是決定病毒-受體相互作用的關鍵序列,也決定著病毒的宿主范圍和嗜性[5]。目前預防豬流行性腹瀉(PED)的疫苗常用甲醛氫氧化鋁滅活苗,但疫苗株與近期流行株同源性較低,能保護仔豬免受PEDV流行株感染的高效廉價的疫苗需求更加迫切[6]。為此,本課題組前期針對高發的GⅡ-a型流行株豬PEDV的纖突蛋白中的受體結合區(receptor-binding domain,RBD),應用桿狀病毒表達系統構建并表達了PEDV-RBD基因[7],研究擬通過仔豬試驗,分析其免疫原性,為PED亞單位疫苗研制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒與主要試劑SF9懸浮細胞系與PEDV(GenBank:OM814174.1)由本實驗室保存;P3代重組桿狀病毒(PEDV-RBD和pFastBacTMDual空載體)、PEDV-RBD蛋白(哺乳動物表達系統制備,質量濃度為0.75 g/L)、PEDV-RBD多克隆抗體由本實驗室制備并保存[7];ImjectTMAlum佐劑購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;雙倍分子佐劑由南通海泰生物科技有限公司林旭埜博士惠贈;CpG序列由本實驗室設計,南京金斯瑞生物科技有限公司合成;HRP標記的山羊抗豬IgG購自碧云天生物技術有限公司;SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、豬外周血淋巴細胞分離液試劑盒購自天津灝洋生物科技有限公司;APC-CD3+、FITC-CD4+、PE-CD8+抗體購自美國BD公司。

1.2 動物3周齡斷乳仔豬購自吉林省金泰美迪生物技術有限公司。

1.3 重組亞單位疫苗大量制備將P3代重組桿狀病毒按照10 MOI接種到細胞密度為2×106個/mL的SF9懸浮細胞中,48 h收獲細胞培養物,680 ×g離心10 min,收取上清。將1.2 L上清用超速離心機50 000 ×g離心2 h,棄上清,用6 mL PBS重懸沉淀。取20 μL用于鑒定和定量,其余分裝凍存于-80℃冰箱。

1.4 目的蛋白的定量將重懸的沉淀按照體積比4∶1于SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)充分混合后煮沸10 min與哺乳動物表達的已知濃度PEDV-RBD蛋白作為標準蛋白同時進行SDS-PAGE電泳之后,將蛋白轉印至NC膜上,以1∶1 000 稀釋的PEDV-RBD多克隆抗體為一抗,1∶5 000 稀釋的山羊抗鼠IgG為二抗,進行Western blot鑒定,重復3次。將Western blot結果進行灰度值分析,根據上樣體積,按照公式:(標準蛋白濃度×上樣體積)/標準蛋白灰度值=(目的蛋白濃度×上樣體積)/目的蛋白灰度值,計算目的蛋白濃度[8]。

1.5 仔豬免疫試驗設置3組,每組5只3周齡仔豬。RT-PCR方法(引物序列F:5′-ACTCTTCT-AGCTGGTACTGTGGC-3′;R:5′-ATCCTGCAA-AGCTGGAATGGC-3′,目的條帶大約300 bp)篩選PEDV核酸陰性,間接ELISA方法篩選PEDV血清抗體陰性的仔豬。候選疫苗組仔豬頸部三角肌注射免疫原含量為500 μg,佐劑為ImjectTMAlum+雙倍分子佐劑+500 μg CpG,與免疫原1∶1體積比混合振蕩乳化10 min;pFastBacTMDual空載體上清和佐劑對照組為免疫對照組。首免后3周加強免疫,每周采血,分離血清保存待檢。

1.5.1仔豬體溫與體質量監測 每2 d測量仔豬體溫和體質量,通過統計仔豬體溫和體質量變化,分析亞單位疫苗及佐劑的安全性。

1.5.2特異性抗體檢測 利用間接ELISA方法檢測特異性抗體水平。根據本實驗室建立的間接ELISA方法(數據待發表),血清稀釋度為1∶400,二抗稀釋度為1∶5 000,按照基本步驟檢測仔豬血清特異性抗體[9]。

1.5.3中和抗體檢測 參照文獻[10]檢測中和抗體水平。將滅活的血清從1∶2稀釋至1∶1 024,每孔加200 TCID50PEDV,于37℃、5%CO2培養箱反應1 h,每孔加入約1×104個Vero細胞,置于培養箱2～3 d,觀察細胞病變情況。

1.5.4流式細胞術分析 免疫后32 d,采集仔豬血液,利用豬外周血淋巴細胞分離液試劑盒分離仔豬淋巴細胞,用RPMI-1640培養基調整淋巴細胞數量為1×106個/mL,用抗豬APC-CD3+、FITC-CD4+、PE-CD8+染色孵育后利用流式細胞術分析CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞水平。

1.6 數據統計分析仔豬血清中特異性IgG水平、中和抗體水平,仔豬體溫和體質量及CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞水平檢測所得數據均采用GraphPad Prism 9.3.0數據統計軟件進行分析,樣本間顯著性檢驗采用t檢驗。

2 結果

2.1 免疫原的定量將標準蛋白與制備的目的蛋白同時進行Western blot鑒定(圖1),將顯影的條帶進行灰度值分析,重復3次,按照公式計算目的蛋白的質量濃度,經計算目的蛋白的質量濃度為1.02 g/L。

M.蛋白Marker;1.目的蛋白;2.空載體對照;3.標準蛋白

2.2 仔豬免疫試驗

2.2.1陰性仔豬的篩選 選取15頭仔豬,按照順序進行編號,根據實驗室建立的方法進行RT-PCR和間接ELISA檢測,選取的仔豬核酸與抗體均為陰性的仔豬進行免疫試驗。

2.2.2仔豬體溫與體質量變化 仔豬每2 d測1次體溫和體質量(圖2):圖2A可見仔豬體溫維持在38.5～39.5℃之間,沒有因為免疫而導致體溫的大幅度波動;圖2B可見各組仔豬體質量均保持穩定增長,首次免疫后體質量增長緩慢,可能與仔豬進食及生長環境有關,之后體質量逐漸上升。以上結果表明,免疫的目的蛋白及添加的佐劑并不影響仔豬的正常生長,安全性較高。

A.仔豬體溫監測;B.仔豬體質量監測

2.2.3特異性抗體檢測結果 仔豬每周采血,分離血清后利用建立的間接ELISA方法進行特異性抗體檢測(圖3)。疫苗組首免后抗體水平只有緩慢上升并很快降低,首免后21 d加強免疫后抗體水平迅速上升至較高水平,28和32 d的免疫組特異性抗體水平顯著高于對照組。32 d的特異性抗體效價為1∶12 800。以上結果表明,目的蛋白能夠誘導體液免疫應答產生特異性抗體。

2.2.4中和抗體檢測結果 將仔豬血清56℃滅活30 min,稀釋倍數從1∶2到1∶2 048,選擇首免后32 d的血清,進行中和抗體檢測,PEDV-RBD蛋白組中和抗體效價中位值為1∶284,最高效價達1∶512(圖4)。

2.2.5仔豬外周血淋巴細胞流式細胞術分析結果 仔豬21 d加強免疫后,32 d采集仔豬血液10 mL,分離淋巴細胞后染色,經流式細胞術分析細胞因子CD3+CD4+、CD3+CD8+雙陽性T淋巴細胞所占比例(圖5)。結果顯示,PEDV-RBD蛋白組細胞因子CD3+CD4+雙陽性T淋巴細胞所占比例略高于空載體對照組,顯著性高于佐劑對照組;表明目的蛋白可誘導仔豬CD3+CD4+雙陽性T淋巴細胞。

A.特異性抗體時間監測;B.特異性抗體效價

**.P<0.001

*.P<0.05;ns.差異不顯著

3 討論

PEDV是導致仔豬腹瀉和死亡的主要病原體,患病仔豬死亡率可達100%,對養豬業造成巨大的經濟損失[11]。國內上市的針對PEDV的疫苗主要是PEDV和TGEV二價滅活疫苗[12]。瑞普生物公司進行了PED和豬傳染性胃腸炎二聯活疫苗的中試研究,通過傳代和克隆技術純化致弱病毒,一次免疫即可有效預防PED和豬傳染性胃腸炎2種豬腹瀉病毒病,具有較高的免疫原性[13]。滅活疫苗安全性好,易于生產,但滅活過程中容易發生突變[14];活疫苗免疫原性高,單次免疫即可誘導較強的免疫應答,但弱毒有返強風險使其使用受限[15]。亞單位疫苗則被視為最安全的疫苗類型,無任何傳染性,但有包含保護性免疫反應的基本抗原[16],雖其免疫原性較低,但通過佐劑或免疫增強劑的融合使用可以增強疫苗的免疫原性[17]。

鋁鹽佐劑是目前應用最廣的一種免疫佐劑,主要有氫氧化鋁和磷酸鋁2種,其中氫氧化鋁的使用更廣泛。目前認為,鋁佐劑的疫苗佐劑效應機制主要有“儲存庫效應”和“免疫刺激效應”2種。“儲存庫效應”即鋁鹽佐劑吸附抗原在接種區域貯存,緩慢釋放,延長抗原作用時間,增強體液免疫;“免疫刺激效應”即鋁鹽佐劑在注射部位吸引大量炎性細胞[18]。添加的鋁鹽佐劑可以提高疫苗免疫原性,并使抗原緩慢釋放,延長抗體保護持續期。CpG基序是未甲基化的寡聚脫氧核苷酸,前期研究發現CpG基序在體外細胞水平上能夠促進豬免疫細胞的分裂和生殖[19]。大量學者對CpG促進豬用疫苗的免疫效力進行了研究,證實CpG序列在豬用疫苗上具有廣泛的應用前景[20-21]。

本課題組在前期利用桿狀病毒表達系統制備了PEDV-RBD重組蛋白[7],本研究對抗原進行定量的基礎上,配合鋁鹽佐劑和CpG序列開展了仔豬免疫原性評價研究。試驗結果表明,與空載體和佐劑對照組相比,PEDV-RBD蛋白組特異性抗體和中和抗體水平表現顯著性升高,表明重組蛋白有效激發了仔豬的體液免疫。CD4+T細胞可分化為多個亞群,通過分泌細胞因子、趨化因子以及募集靶細胞等在細胞免疫中發揮重要作用,可以幫助清除胞內病原體,調節免疫反應,產生記憶細胞等[22]。流式細胞術分析顯示,PEDV-RBD蛋白組仔豬的CD3+CD4+雙陽性細胞因子略高于空載體對照組和佐劑對照組,表明重組蛋白能夠誘導一定的細胞免疫水平。

綜上所述,本研究成功制備了PEDV-RBD重組蛋白,并免疫了仔豬,證明其有良好的免疫原性。這為進一步利用桿狀病毒載體制備亞單位疫苗奠定了基礎,也為利用昆蟲桿狀病毒表達系統進行其他冠狀病毒蛋白的免疫研究提供了借鑒和參考。