基于網絡藥理學和分子對接研究復方抗感顆粒防治流感的作用機制及驗證

宋端慧, 鄭瑞芳, 胡 旭, 蘇文靈, 王雪萌, 王 玥, 邢建國

(1石河子大學藥學院, 新疆 石河子 832002; 2新疆維吾爾自治區藥物研究所, 烏魯木齊 830004;3新疆維吾爾藥重點實驗室, 烏魯木齊 830002)

流行性感冒(流感)是由流感病毒感染引發的急性呼吸系統疾病,患者臨床癥狀表現為發燒、流鼻涕、喉嚨痛,嚴重可能繼發細菌感染進而導致肺炎[1]。目前,治療和預防流感的藥物主要有神經氨酸酶抑制劑如奧司他韋和扎那米韋,M2蛋白離子通道抑制劑如金剛烷胺和金剛乙胺,但這些藥物多存在不良反應,高耐藥性和經濟負擔高等問題[2-3],尋找和開發其他藥物治療和防治流感成為研究的熱點。復方抗感顆粒(CAG)由神香草、金蓮花、歐李等共9味藥材組成,主要功效為消退熱毒、消瘟除疫、提高機體免疫力,臨床主要用于流感的預防和治療。本研究采用網絡藥理學[4]和分子對接技術探究復方抗感顆粒抗流感的活性成分,預測關鍵作用靶點及抗病毒的作用機制,通過細胞實驗進行初步驗證,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥復方抗感顆粒(新疆維吾爾自治區藥物研究所提供,20220628),p-AKT1抗體 (武漢愛博泰克生物科技有限公司,AP0140),AKT1抗體 (武漢愛博泰克生物科技有限公司,A11016),p-PI3K抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司,AP0854),PI3K抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司,A0982),RIPA(強)裂解液(北京索萊寶科技有限公司,R0010),PMSF(北京索萊寶科技有限公司,P0100),0.25%胰酶-EDTA溶液(美國HyClone公司,SH30042.01),HRP標記的山羊抗兔IgG(中杉金橋公司,ZB-2301),胎牛血清(簡稱FBS,美國HyClone公司,SH30084.02),BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司,23227),CCK-8試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司,AR1199),DMEM培養基(美國HyClone公司,SH30262.01)。

1.2 儀器HERA cell-150i型細胞培養箱(美國Thermo Fisher Scientific公司),A2型生物安全柜(美國Thermo Fisher Scientific公司),Evos FLoid細胞成像工作站(美國Thermo Fisher Scientific公司),PowerPacTM通用電泳儀(美國Bio-Rad公司),Mini-PROTEAN?Tetra電泳槽(美國Bio-Rad公司),TGL-16K型高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司),SPARK 20M多功能微孔板檢測儀(瑞士TECAN公司),HVS-1000型超凈臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)。

1.3 流感病毒及細胞株甲型流感病毒(A/Puerto Rico/8/34)鼠適應株(H1N1),犬腎(MDCK)細胞購自中國疾病預防與控制中心病毒病預防與控制研究所;其中甲型H1N1流感病毒在中國醫學科學院生物技術研究所培育,保存在-80℃冰箱中,備用。

1.4 復方抗感顆粒的活性成分篩選及靶點預測基于中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP數據庫,https://tcmspw.com/),中藥分子機制生物信息學分析工具(BATMAN-TCM數據庫,http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/),中藥綜合數據庫(TCMID數據庫,https://www.megabionet.org/tcmid/)收集復方抗感顆粒9味藥材的成分,將收集的單味藥材成分經PubChem網站(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索3D結構,將3D結構文件導入Swiss ADME (https://www.swissadme.ch/),進行ADME篩選,將滿足胃腸吸收度為高(High)、生物利用度≥0.5的藥材成分作為CAG的潛在活性成分,運用SwissTargetPrediction平臺(https://www.swisstargetprediction.ch/)進行潛在活性成分靶點預測,限定研究物種為“homosapiens”, 篩選可能性≥0.1的潛在活性成分靶點蛋白,形成靶點集。

1.5 流感靶點獲取通過DrugBank數據庫(https://go.drugbank.com/)、在線人類孟德爾遺傳數據庫(OMIM數據庫,https://omim.org/)和GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/),檢索關鍵詞“流感”,匯總得到流感相關的靶點集。

1.6 CAG活性成分-流感靶點篩選運用Venny 2.0.1平臺將收集得到的CAG潛在活性成分和收集得到的流感靶點取交集,繪制韋恩圖,共有的交集是CAG潛在活性成分和流感的潛在共同靶點。

1.7 構建蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-Protein Interaction, PPI)網絡圖將獲取的潛在共同靶點導入STRING數據庫(https://cn.string-db.org/),限定研究物種為“homosapiens”,將最低相互作用得分設置為0.9,篩選潛在靶點,得到PPI網絡圖。根據結果篩選的含有潛在靶點的化學成分,為CAG的活性成分。將PPI網絡圖導入Cytoscape 3.9.0軟件,運用網絡分析工具進行拓撲分析,計算出平均度值,根據其篩選得到成分-流感共同靶點,并將平均度值排名前10的靶點作為核心靶蛋白。

1.8 構建“藥物-成分-靶點”網絡將CAG活性成分、復方成分-流感共同靶點及其相互關系導入Cytoscape 3.9.0軟件進行可視化處理,構建藥物-成分-靶點網絡,并依據度值排名篩選出核心成分。

1.9 KEGG通路和GO功能富集分析利用DAVID數據庫(https://david. ncifcrf. gov/)對“1.6”項下的潛在共同靶點進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of gene and genomes, KEGG) 通路富集分析和基因本體(gene ontology, GO)功能富集分析,GO分析包括生物過程(Biological Process,BP)、細胞組成(Cellular Component,CC)和分子功能(Molecular Function, MF),富集分析條件為錯誤發現率(False discovery rate, FDR)<0.05,將富集分析結果的前30項分別進行可視化。

1.10 分子對接驗證從蛋白質結構數據庫(PDB數據庫,https://www.rcsb.org/)獲取“1.6”項下獲得的核心靶點3D結構,結合UniPort數據庫(https://www.uniprot.org/)下載前“1.4”的關鍵成分3D結構,篩選出分辨率高、結構完整的蛋白結構;將核心成分輸入TCMSP數據庫,獲得其3D結構式。采用Autodock 4.2.6軟件對下載的3D結構進行半柔性對接,根據對接結果,將結合能最低的5項在Pymol軟件進行可視化。

1.11 體外細胞驗證實驗

1.11.1 細胞及病毒培養 本研究所用細胞維持液為含10%FBS的DMEM培養基,在37℃CO2(5%)的細胞培養箱中培養。流感病毒株采用9日齡SPF級雞胚傳代,采用Reed-Muench法測定病毒在MDCK細胞中的半數組織培養感染劑量(TCID50)為1×105TCID50/mL。

1.11.2 藥物細胞毒性實驗 為確定CAG對MDCK細胞的安全濃度范圍,取對數生長期的MDCK細胞,以2.5×104個/孔接種至96孔板,按“1.11.1”項下條件培養,用二甲基亞砜(DMSO)溶液將復方抗感顆粒配置成濃度為80 mg/mL的儲備液,待細胞生長成單層后,吸出培養液,PBS洗滌2次,采用細胞維持液配置倍比稀釋的藥物稀釋液(40～607.5 μg/mL),并設空白對照組(僅含100 μL細胞維持液)、正常細胞對照組(加入100 μL細胞維持液培養)和實驗組(加入100 μL CAG藥物稀釋液培養),培養2 d后,每孔加入5 mg/mL的CCK-8的細胞維持液20 μL,在37℃CO2(5%)培養箱中孵育4 h,棄去細胞上清液,每孔加入100 μL的DMSO溶液,在酶標儀450 nm波長下測定吸光度(OD)值,計算細胞存活率,細胞存活率=[(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)]×100%。

1.11.3 藥物抗流感病毒實驗 取對數生長期的MDCK細胞,以2.5×104個/孔接種至96孔板,按“1.11.1”項下條件培養,待細胞生長成單層后,吸出培養液,PBS洗滌2次,加入采用細胞維持液倍比稀釋的藥物稀釋液(40～180 μg/mL),并設對照組(100 μL細胞維持液培養)、模型組(僅加入流感病毒懸液)、CAG給藥組(分別加入100 μL的40、80、120、180 μg/mL的CAG藥物稀釋液培養),培養24 h后,每孔加入100 μL含80 TICD50的流感病毒懸液,感染2 h后,棄去病毒懸液,繼續孵育24 h,按照“1.11.2”項下的方法進行CCK-8測定,計算流感病毒抑制率,病毒抑制率=[(OD給藥組-OD模型組)/(OD對照組-OD模型組)]×100%。

1.11.4 蛋白免疫印記法(Western blot)檢測PI3K、AKT1、p-PI3K、p-AKT1蛋白表達水平 取對數生長期的MDCK細胞,以4×105個/孔接種于6孔板,按“1.11.1”項下條件培養,待細胞生長成單層后,吸出培養液,PBS洗滌2次,隨機分為對照組(100 μL細胞維持液培養)、模型組(僅加入流感病毒懸液)、CAG給藥組(分別加入100 μL的80、120、180 μg/mL的CAG藥物稀釋液),培養24 h,棄去培養液,除對照組外每孔加入100 μL含80 TICD50的流感病毒懸液,感染2 h后,棄去病毒懸液,繼續孵育24 h,棄去培養液,用PBS洗滌2次,每孔加入150 μL的裂解液(1%PMSF和1%蛋白磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液),冰浴30 min,離心(12 000 r/min, 20 min, 4℃),離心結束后取上清液,采用BCA蛋白定量試劑盒測定樣品蛋白含量,然后分別加入上樣緩沖液,金屬浴(100℃,5 min),結束后將樣品于-20℃環境下保存。配制SDS-PAGE凝膠,進行蛋白樣品電泳,然后電轉至PVDF膜,用封閉液(5%脫脂奶粉)封閉2 h,封閉結束后,用1×TBST洗滌3次,孵育一抗(PI3K、AKT1、p-PI3K、p-AKT1抗體),4℃孵育過夜,用1×TBST洗滌3次,加入相應的HRP標記的IgG二抗室溫孵育2 h,孵育結束后,經ECL顯影曝光,采用化學發光成像系統拍照,并采用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

2 結果

2.1 復方抗感顆粒活性成分及靶點信息滿足胃腸吸收度為High、生物利用度≥0.5、類藥性至少2個Yes條件的活性成分共有613個,probability≥0.1的活性成分靶點共有1 204個。收集得到流感基因共946個。運用Venny平臺,將復方抗感顆粒活性靶點與流感靶點取交集,得到205個潛在靶點,并繪制韋恩圖,見圖1。

圖1 復方抗感顆粒活性靶點與流感靶點韋恩圖

2.2 復方抗感顆粒防治流感的PPI網絡分析PPI網絡共有202個節點和5 954條邊,見圖2。相互作用的蛋白有202個,平均度值為29.475,大于平均度值的有69個共同靶點,按照度值的大小列出前30個靶點,見表1。將PPI網絡導入Cytoscape 3.9.0,繪制核心靶基因圖,見圖3。度值越大,顏色越紅,表示與其他蛋白的關系越密切,將度值排名前10的靶點作為復方抗感顆粒治療流感的核心靶點基因,包括AKT1、ALB、GAPDH、TNF、IL6、VEGFA、IL1B、SRC、STAT3、EGFR。

圖2 復方抗感顆粒防治流感的PPI網絡

圖3 PPI網絡的核心靶基因

表1 PPI網絡的靶基因(排名前30)

2.3 “CAG藥物-成分-潛在靶點”網絡構建CAG藥物活性成分與流感潛在靶點網絡,共有371個節點,3 174條邊。根據拓撲學分析,其平均度值為17.097,度值越大,說明連接度越大,在網絡中的位置越重要。將度值排名前15的藥物成分作為CAG核心成分,包括山柰酚、槲皮素、木犀草素、芹菜素、鼠尾草素等,見表2。

表2 復方抗感顆粒核心成分對照表(排名前15)

2.4 復方抗感顆粒的KEGG分析利用DAVID數據庫進行KEGG富集分析,得到167條通路(P<0.05)去除具體疾病通路如脂質和動脈粥樣硬化,麻疹, 弓形蟲病和痢疾等,再篩選去除無關的通路后,將剩下30條通路按照顯著性繪制氣泡圖,見圖4。氣泡的大小代表通路中涉及的藥物-流感共同靶點,可以看出涉及靶點的通路有PI3K-AKT信號通路、甲型流感通路、冠狀病毒-新冠肺炎通路等,顏色由綠到紅,說明FDR從大到小,FDR越小,顏色越紅,顯著性越高,其中,甲型流感、冠狀病毒-新冠肺炎的通路顯著。橫坐標基因比例(gene ratio)代表藥物-流感共同靶點的數量占該通路總靶點的數量,其中,復方抗感顆粒的活性成分抗流感的主要通路為PI3K-AKT信號通路、甲型流感通路、冠狀病毒-新冠肺炎通路。

圖4 復方抗感顆粒KEGG 通路分析圖

2.5 “CAG成分-靶點-通路”網絡結構及分析將KEGG富集分析的前30條通路、通路相關靶點以及對應的復方抗感顆粒的藥物成分導入Cytoscape 3.9.0軟件,繪制“成分-靶點-通路”網絡圖,其中共有310個節點,2 504條邊。紅色方框代表作用靶標,藍色圓形節點表示藥物成分,綠色箭頭代表流感治療相關通路,直觀地體現出CAG抗流感的多靶點、多通路的特點,見圖5。

圖5 CAG成分-靶點-通路圖

2.6 GO富集分析利用DAVID數據庫對核心靶點基因進行GO功能條目富集分析,共得到939個條目。其中,生物過程有690個條目,涉及炎癥反應、白細胞介素-8產生的正調節、缺氧反應等方面;細胞組成有92個條目,主要涉及細胞質、質膜、細胞質等方面;分子功能有157個條目,主要涉及酶結合、相同蛋白結合、血紅素結合等方面。根據生物過程、細胞組成、分子功能富集分析結果,分別選擇FDR高的10條GO條目繪制柱形圖,見圖6。

圖6 復方抗感顆粒核心靶基因的GO功能分析

2.7 分子對接結果選取度值前5的活性成分山柰酚、槲皮素、木犀草素、芹菜素、鼠尾草素和PPI網絡篩選的度值前3的靶點蛋白AKT1、ALB、GAPDH進行分子對接。結合能越小,表示親和力越好,結合能小于-5 kcal/mol認為對接結果良好。本研究對接結果均小于-5 kcal/mol,說明復方抗感顆粒核心活性成分與核心靶點具有良好的親和力,分子對接結合能見表3。根據結合能的大小,排名前4位的活性成分與靶蛋白的對接模式,見圖7。其中,結合能最小的是芹菜素和靶蛋白ALB (PDB ID: 7QFE),結合能是-7.72 kcal/mol,芹菜素與ALB形成2個氫鍵,連接的氨基酸殘基為LEU-135和ARG-117,氫鍵用黃色表示,其長度分別為2.3和1.8。

表3 核心活性成分和關鍵作用靶點的結合能

A 芹菜素-ALB對接圖

B 鼠尾草素-ALB對接圖

C 木犀草素-GAPDH對接圖

D 鼠尾草素-AKT1對接圖圖7 靶點與成分分子對接圖

2.8 細胞驗證實驗結果

2.8.1 不同濃度CAG對MDCK細胞活力影響 與對照組比較,復方抗感顆粒提取物組濃度在40～180 μg/mL時,細胞存活率在90%以上,表明該濃度范圍內藥物對MDCK細胞的存活率無明顯影響;藥物濃度在270～607.5 μg/mL時細胞存活率顯著下降(P<0.01),見表4。因此選擇給藥濃度為80～180 μg/mL進行后續實驗。

表4 不同濃度CAG對細胞活力的影響

2.8.2 不同濃度CAG對流感感染MDCK細胞活力的影響 與對照組比較,模型組的細胞存活率顯著降低(P<0.01);與模型組比較,80、120、180 μg/mL CAG劑量組存活率均有明顯升高(P<0.05) ,見表5。因此后續實驗采用的給藥劑量為80、120、180 μg/mL。

表5 復方抗感顆粒對流感感染細胞模型細胞活力的影響

2.8.3 CAG對流感病毒感染MDCK細胞對PI3K-AKT1相關蛋白水平的影響 與對照組比較,模型組PI3K表達量升高,差異有統計學意義(P<0.01),見圖8。與模型組比較,給藥組p-PI3K/PI3K的蛋白表達量比值降低,差異有統計學意義(P<0.01),見圖9。與對照組比較,模型組AKT1表達量升高,差異有統計學意義(P<0.01);與模型組比較,給藥組p-AKT1/AKT1的比值下降,差異有統計學意義(P<0.01),見圖10。

圖8 p-PI3K、p-AKT1、AKT1、PI3K的蛋白電泳圖

(注:與對照組比較, ##P<0.01;與模型組比較, *P<0.05, **P<0.01)圖9 p-PI3K與PI3K的蛋白表達量比值圖

(注:與對照組比較, ##P<0.01;與模型組比較, *P<0.05, **P<0.01)圖10 p-AKT1與AKT1的蛋白表達量比值圖

3 討論

本研究得到復方抗感顆粒治療流感的核心成分包括山柰酚、槲皮素、木犀草素、芹菜素、鼠尾草素等,AKT1、ALB、GAPDH、IL-6、SRC、EGFR是復方抗感顆粒抗流感的重要靶點。AKT1、EGFR、SRC在細胞信號轉導中有關鍵作用,靶向治療能增強細胞抗病毒宿主防御[5],ALB是維持血液滲透壓的重要物質,對炎癥反應具有調節作用[6]。GAPDH是細胞調節因子,參與DNA修復以及細胞凋亡等生物過程[7]。IL-6可介導炎癥反應,對宿主免疫應答血細胞生成和癌癥進行調節[8]。由此可推測復方抗感顆粒治療和預防流感的主要作用靶點與細胞信號轉導、炎癥反應、細胞凋亡等密切相關。

KEGG富集分析顯示,復方抗感顆粒主要參與PI3K-AKT信號通路、甲型流感、冠狀病毒-新冠肺炎。PI3K-AKT信號通路是參與免疫調節、信號轉導、炎癥反應的重要通路[9],在甲型流感病毒的增殖作用也有重要作用,在病毒復制的早期階段,病毒利用PI3K-AKT信號通路抑制宿主細胞的凋亡速度,保證病毒的復制和蛋白質的合成,進而增強病毒的增殖能力[10]。根據分子對接結果分析,山柰酚、槲皮素、木犀草素、芹菜素、鼠尾草素等成分作用于AKT1、ALB等靶點防治流感。山柰酚、槲皮素、木犀草素、芹菜素、鼠尾草素是黃酮類化合物,黃酮類化合物在抗病毒和抗炎的分子機制不同。山柰酚可以抑制MyD88/TLR4介導的MAPKs和NF-κB通路,對病毒介導的炎癥具有保護作用,可減輕急性肺損傷的炎癥程度和氧化應激損傷[11-12]。槲皮素能清除自由基,保護宿主細胞免受活性氧誘導的損傷,通過抑制Caspase-3蛋白的表達,具有抗細胞凋亡的作用[13-14]。木犀草素可以降低甲型流感病毒的復制量,起到抗病毒的作用[15]。芹菜素可以減輕炎癥反應,降低病毒的復制效率[16-17]。核心成分與關鍵靶點的分子對接的結合能均較小,說明親和性好,核心成分和流感疾病相關的靶點有很好的結合活性。

根據Western blot細胞實驗驗證的結果,復方抗感顆粒可以下調PI3K和AKT1的蛋白水平,推測復方抗感顆粒通過作用于PI3K-AKT信號通路,調節下游炎癥反應,影響酶活性,發揮免疫調節,抑制病毒的復制等來發揮預防和治療流感的藥效。

綜上所述,復方抗感顆粒通過調節PI3K-AKT、甲型流感通路,作用于AKT1、PI3K、ALB等疾病靶點,干預炎癥反應、轉移酶活性、免疫調節等生物學過程,來防治流感。本研究利用網絡藥理學篩選出復方抗感顆粒的活性成分,預測治療流感的作用靶點,利用分子對接技術驗證復方抗感顆粒活性成分與作用靶點具有良好的結合活性,并對其作用機制進行細胞實驗驗證,對后續的實驗設計和藥物開發具有參考意義。