安胃瘍膠囊促胃動力作用及防治慢性非萎縮性胃炎作用機制研究

張 薇, 秦冬梅, 冀祖恩, 孫琰琴, 羅恒磊, 于水蓮, 彭一峰

(1新疆甘草及制品研究重點實驗室; 2新疆全安藥業股份有限公司, 新疆 庫爾勒 841011; 3石河子大學藥學院, 新疆 石河子 832002)

慢性非萎縮性胃炎是臨床常見的消化系統疾病,以胃小凹之間的固有膜內有炎性細胞浸潤為特征,發病率高,發病機制尚不明確,臨床表現缺乏特異性,主要表現為非特異性消化不良,如上腹部不適、飽脹、疼痛、食欲不振、噯氣、泛酸等[1]。西醫主要采用內鏡與病理檢查進行診斷,以質子泵抑制劑和胃黏膜保護劑對癥治療為主,多存在不良反應、易反復、患者依從性差等問題[2]。中醫藥治療多采用中藥多組分、多靶點協同作用,在慢性非萎縮性胃炎治療中具有獨特優勢,且安全性高,療效確切[3]。安胃瘍膠囊由新疆全安藥業股份有限公司生產,主要成分為總黃酮,具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗潰瘍等作用,臨床上主要用于胃及十二指腸球部潰瘍的治療[4]。本研究采用胃動力不足小鼠模型和慢性非萎縮性胃炎動物模型,探究安胃瘍膠囊促胃動力作用及治療慢性非萎縮性胃炎的作用機制,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級SD大鼠,雌雄對半,體重180～220 g,由重慶市中藥研究院實驗動物研究所提供,動物生產許可證號:SCXK(渝)2012-0006,合格證號:0004652。SPF級昆明(KM)小鼠,雌雄對半,體重18～22 g,中國人民解放軍第三軍醫大學實驗動物中心提供,動物生產許可證號:SCXK(軍)2012-0011,合格證號:0008104。實驗動物飼養環境:室溫20℃～25℃,相對濕度40%～70%, 12 h/12 h晝夜明暗交替,所有動物均自由進食飲水。

1.2 試藥安胃瘍膠囊(新疆全安藥業股份有限公司,20180704),胃乃安膠囊(廣州白云山中一藥業有限公司,W00074),甲氧氯普胺片(山西云鵬制藥有限公司,G180621),脫氧膽酸鈉(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司,40N10202),硫酸阿托品注射液(天津金耀藥業股份有限公司,1803061),胃蛋白酶(PP)試劑盒(南京建成生物工程研究所,20180922),胃泌素(GAS)試劑盒(E20180901A)、胃動素(MTL)試劑盒(E20181107A)、白介素1β(IL-1β)試劑盒(E20180622A)、白介素8(IL-8)試劑盒(E20181113A)、前列腺素E2(PGE2)試劑盒(E20180524A)均購自上海繼錦化學科技有限公司;氨水(20180413)、乙醇(20181107)購自重慶川東化工集團有限公司化學試劑廠。

1.3 儀器Multifuge-X型3R低溫高速離心機(美國Thermo Fisher公司),ST-360型酶標儀(科華試驗系統有限公司),BX51型生物顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社),DW-86L386型超低溫保存箱(Haier集團有限公司),CLW-1020J-RO型純水儀(乾崍儀器有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 大鼠胃運動實驗 取60只SD大鼠,隨機分為空白對照組(純化水),安胃瘍低、中、高劑量組(安胃瘍膠囊 82、164、328 mg/kg體重),胃乃安組(胃乃安370 mg/kg體重),甲氧氯普胺組(甲氧氯普胺3 mg/kg體重),每組10只,給藥后禁食不禁水24 h后麻醉,采用BL-420S生物機能實驗系統測定各組大鼠0、5、15、30、45、60 min時胃收縮頻率和胃收縮幅度。

1.4.2 小鼠胃動力實驗[5-6]取70只KM小鼠,隨機分為空白對照組(純化水)、模型組(純化水),安胃瘍低、中、高劑量組(安胃瘍膠囊164、328、656 mg/kg體重),胃乃安組(胃乃安740 mg/kg體重),甲氧氯普胺組(甲氧氯普胺6 mg/kg體重),每組10只,給藥3 d后,各組皮下注射硫酸阿托品5 mg/kg體重(空白對照組除外)15 min后,灌胃給予含活性炭末的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)黑色半固體糊0.8 mL/只,取胃稱全重和凈重,計算胃內殘留率,胃內殘留率=(胃全重-胃凈重)/所灌半固體糊的重量×100%。

1.4.3 大鼠胃液分泌實驗 取60只SD大鼠,隨機分為空白對照組(純化水)、安胃瘍低、中、高劑量組(安胃瘍膠囊82、164、328 mg/kg體重)、胃乃安組(胃乃安370 mg/kg體重)、甲氧氯普胺組(甲氧氯普胺3 mg/kg體重),連續給藥7 d后,禁食不禁水24 h,酸堿滴定法測定胃液酸度(包括游離酸及總酸度),采用胃蛋白酶(PP)試劑盒測定胃液PP活性。

1.4.4 大鼠慢性非萎縮性胃炎模型實驗[7-8]取70只SD大鼠,隨機分為空白對照組(純化水)、模型組、安胃瘍低、中、高劑量組(安胃瘍膠囊82、164、328 mg/kg體重)、胃乃安組(胃乃安370 mg/kg體重)、甲氧氯普胺組(甲氧氯普胺3 mg/kg體重),每組10只。空白對照組自由飲食,其余各組自由飲用氨水(第1～6周0.05%氨水、第7～12周0.1%氨水),每天灌服2 mL脫氧膽酸鈉(20 mmoL/L),每間隔3 d空腹灌服2 mL60%乙醇,2 d足量喂食飼料,1 d禁食,連續12周后,空白對照組和模型組給予同體積純化水,其他各組給予相應的藥物,連續30 d,禁食不禁水24 h后,大鼠腹主動脈取血,4℃下3 500 r/min離心15 min,取血清,采用酶聯免疫試劑盒(ELISA法)測定血清IL-8、MTL、GAS水平。取全胃,量取胃液量,用pH計測定胃液pH值,酸堿滴定法測定胃液酸度,胃蛋白酶(PP)試劑盒測定胃液PP活性[9-10]。用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4)固定胃組織15 min,沿胃大彎剪開,肉眼觀察胃粘膜損傷情況并進行評分,計算胃粘膜損傷指數[11]。取PBS固定的胃組織,用預冷生理鹽水進行勻漿(1∶9),4℃下3 000 r/min離心15 min,取上清液,采用酶聯免疫試劑盒測定IL-1β、PGE2水平。用10 %中性甲醛固定胃組織,常規石蠟包埋切片,用蘇木素-伊紅(HE)染色,顯微鏡下觀察胃組織學情況,進行半定量評分;用阿利新藍-糖蛋白結合法(AB-PAS)染色,顯微鏡下觀察評價胃粘膜上皮細胞功能。

2 結果

2.1 安胃瘍膠囊對大鼠胃收縮頻率及收縮幅度的影響與空白對照組比較,安胃瘍低、中、高劑量組、胃乃安組和甲氧氯普胺組胃收縮頻率及收縮幅度差異均無統計學意義(P>0.05),見表1、2。

表1 安胃瘍膠囊對大鼠胃收縮頻率的影響

表2 安胃瘍膠囊對大鼠胃收縮幅度的影響

2.2 安胃瘍膠囊對小鼠胃動力的影響與空白對照組比較,模型組小鼠胃內殘留率升高,差異有統計學意義(P<0.01);與模型組比較,安胃瘍中、高劑量組胃內殘留率降低,差異有統計學意義(P<0.05);與胃乃安組、甲氧氯普胺組比較,安胃瘍高劑量組胃內殘留率無明顯變化,差異無統計學意義(P>0.05),見表3。

表3 安胃瘍膠囊對小鼠胃動力的影響

2.3 安胃瘍膠囊對正常大鼠胃液指標的影響與空白對照組比較,安胃瘍低、中、高劑量組、胃乃安組、甲氧氯普胺組胃液量、胃液酸度(包括游離酸及總酸度)、胃蛋白酶活性差異均無統計學意義(P>0.05),見表4。

表4 安胃瘍膠囊對正常大鼠胃液指標的影響

2.4 安胃瘍膠囊對慢性非萎縮性胃炎大鼠胃液指標的影響與空白對照組比較,模型組胃液量、胃液酸度、pH值、胃液PP升高,差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較,安胃瘍高劑量組和甲氧氯普胺組胃液量降低;安胃瘍低、中、高劑量組、胃乃安組、甲氧氯普胺組PP降低;安胃瘍中、高劑量組、甲氧氯普胺組pH值降低;安胃瘍高劑量組、胃乃安組、甲氧氯普胺組游離酸降低;安胃瘍中、高劑量組、胃乃安組、甲氧氯普胺組總酸度含量降低,差異有統計學意義(P<0.05)。與甲氧氯普胺組比較,安胃瘍高劑量組胃液量、pH值差異無統計學意義(P>0.05);與胃乃安組、甲氧氯普胺組比較,安胃瘍中劑量組總酸度差異無統計學意義(P>0.05),見表5。

表5 安胃瘍膠囊對慢性非萎縮性胃炎大鼠胃液指標的影響

2.5 安胃瘍膠囊對慢性非萎縮性胃炎大鼠胃粘膜損傷的影響與空白對照組比較,模型組大鼠胃壁充血水腫,色淡,表面粗糙,凹凸不平,有散在斑點或條狀出血,胃粘膜損傷指數升高,差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組大鼠比較,安胃瘍高劑量組、甲氧氯普胺組大鼠胃組織明顯改善,胃壁表面較光滑,色澤淡紅,胃壁略有增厚,胃粘膜損傷指數降低,差異有統計學意義(P<0.05),見表6。

表6 安胃瘍膠囊對慢性非萎縮性胃炎大鼠胃粘膜損傷指數的影響

2.6 安胃瘍膠囊對慢性非萎縮性胃炎大鼠胃組織病理學影響與空白對照組比較,模型組大鼠胃組織中度充血,出血伴輕度上皮細胞壞死脫落,胃組織病理學檢查評分升高,差異有統計學意義(P<0.01);胃黏膜腺體萎縮,不規則,腺體稀疏,胃黏膜上皮細胞粘蛋白指數、酸性粘蛋白指數降低,差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,安胃瘍低、中、高劑量組、胃乃安組和甲氧氯普胺組胃組織病理學檢查評分降低,差異有統計學意義(P<0.05);安胃瘍中、高劑量組、胃乃安組和甲氧氯普胺組胃黏膜上皮細胞粘蛋白指數升高,差異有統計學意義(P<0.05),安胃瘍中劑量組胃粘膜酸性粘蛋白指數升高,差異有統計學意義(P<0.05)。與胃乃安組比較,安胃瘍中、高劑量組胃組織病理學檢查評分與胃黏膜上皮細胞粘蛋白指數差異均無統計學意義(P>0.05),見圖1、2,表7。

圖1 各組大鼠胃組織染色圖(HE,×400)

圖2 各組大鼠胃黏膜上皮細胞染色圖(AB-PAS,×100)

表7 安胃瘍膠囊對慢性非萎縮性胃炎大鼠胃組織病理學的影響

2.7 安胃瘍膠囊對慢性非萎縮性胃炎大鼠血清IL-8、MTL、GAS水平的影響與空白對照組比較,模型組IL-8、GAS升高,MTL降低,差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較,安胃瘍低、中、高劑量組、胃乃安組和甲氧氯普胺組IL-8降低;安胃瘍中、高劑量組、胃乃安組和甲氧氯普胺組GAS降低,MTL升高,差異有統計學意義(P<0.01)。與胃乃安組比較,安胃瘍中、高劑量組IL-8、 MTL無明顯變化,與甲氧氯普胺組比較,安胃瘍中、高劑量組GAS變化不大,差異均無統計學意義(P>0.05),見圖3。

2.8 安胃瘍膠囊對慢性非萎縮性胃炎大鼠胃組織IL-1β、PGE2水平的影響與空白對照組比較,模型組IL-1β升高,PGE2降低,差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較,安胃瘍中劑量組IL-1β降低,差異有統計學意義(P<0.05),安胃瘍高劑量組、胃乃安組和甲氧氯普胺組IL-1β降低,差異有統計學意義(P<0.01);安胃瘍低、中、高劑量組PGE2升高,差異有統計學意義(P<0.05)。與胃乃安組和甲氧氯普胺組比較,安胃瘍高劑量組PGE2差異無統計學意義(P>0.05),見圖4。

注:與空白對照組比較, *P<0.05, **P<0.01; 與模型組比較, #P<0.05, ##P<0.01。圖4 安胃瘍膠囊對慢性非萎縮性胃炎大鼠胃組織IL-1β、PGE2水平的影響

3 討論

本研究通過測定給藥前后正常小鼠及胃動力不足小鼠的胃內殘留率,發現安胃瘍膠囊具有調節胃動力作用。GAS是影響胃酸分泌及幽門括約肌松弛的主要激素介質,GAS過度釋放,可造成胃液酸度、胃液PP活性增加,刺激胃腸道運動的MTL水平降低,導致胃黏膜損傷[12]。本研究發現安胃瘍膠囊通過調節慢性非萎縮性胃炎大鼠胃腸激素水平,減少胃酸分泌,降低胃液酸度,進而降低胃蛋白酶活性,減輕對胃粘膜的損傷。通過觀察胃黏膜損傷及胃組織病理學變化,測定與機體炎癥程度呈正相關的IL-1β、IL-8水平和對胃粘膜起重要保護作用的PGE2[13-14],發現安胃瘍膠囊對慢性非萎縮性胃炎模型動物炎癥的抑制,及對粘膜的保護、修復作用,與抑制IL-1β、IL-8表達,提高體內PGE 2水平密切相關。本次研究為后續安胃瘍膠囊改良型新藥的研發提供了理論基礎。