雀異黃酮對甲基苯丙胺誘導的神經細胞損傷保護作用及氧化應激機制研究

孫曉虹, 葛小霞, 阿力木·吾甫爾

(新疆醫科大學第一附屬醫院1健康管理中心, 2神經內科, 烏魯木齊 830054)

甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)是脂溶性苯丙胺類精神興奮劑,易透過血腦屏障損傷中樞神經系統,長期濫用METH可導致幻聽、幻視、焦慮、抑郁等行為及精神障礙,濫用人群低齡化,對社會具有一定的危害性[1-2]。目前有關METH神經毒性作用機制尚未完全闡明,臨床仍缺乏有效防治藥物。金雀異黃酮(Genistein,GEN)提取自大豆、小麥、玉米等植物,是大豆異黃酮的主要成分,約占大豆異黃酮總含量的60%,在抑制細胞凋亡、減少神經炎癥等方面有重要作用[3]。林志軍等[4]研究顯示,GEN可有效抑制心肌細胞缺血再灌注模型的氧化應激損傷,發揮保護作用。目前關于GEN對METH誘導的神經細胞損傷的影響及其作用機制尚不清楚。有研究表明,METH誘導的神經細胞損傷與氧化應激關系密切[5],GEN能否通過氧化應激途徑修復神經細胞損傷尚不可知,因此本研究探尋GEN對METH誘導的神經細胞損傷及氧化應激的影響及可能的機制,為臨床防治METH神經毒性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系PC12細胞(北京百歐博偉生物技術有限公司);GEN,純度>98%(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,C1431128);甲基苯丙胺,純度≥99.8%(北京北方偉業計量技術研究院,107762);阿立哌唑口腔崩解片(成都康弘藥業集團股份有限公司,國藥準字:H20041501);DMEM培養基(3-2020)、四唑鹽(MTT,0793-5G)均購自美國Sigma公司;AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡試劑盒(上海撫生實業有限公司,FS-79505);超氧化物歧化酶試劑盒(SOD,FT-D23758)、丙二醛試劑盒(MDA,BC0025-100)均購自上海梵態生物科技有限公司;活性氧(ROS)含量測定試劑盒(上海將來實業股份有限公司,YT6089);兔抗鼠B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2,Ab32124)、核因子E2相關因子2(Nrf2,Ab137550)、血紅素加氧酶-1(HO-1,Ab13248)均購自美國Abcam公司。兔抗鼠Bcl-2相關X蛋白(Bax)一抗(K001593P)、HRP標記山羊抗兔二抗(K006153P)均購自亞科因(武漢)生物技術有限公司。CO2培養箱(日本sanyo公司,NHD DYE1738型);Elx800酶標儀(美國Thermo公司,HSG9832型);流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司,CytoFLEX SRT型)。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組及處理 用含10%滅活胎牛血清(FBS)、青鏈霉素的DMEM培養基培養PC12細胞,培養條件:37℃、5%CO2、95%飽和濕度。取對數生長期的PC12細胞,以2.5×105/mL密度接種于24孔板,待融合80%左右時,更換無FBS的培養基,并隨機分為5組,每組設6個復孔。空白對照組PC12細胞不做任何處理,用無FBS培養基繼續培養24 h;METH組用終濃度為3 mmol/L METH溶液[6]的無FBS培養基繼續培養24 h;GEN低、中、高劑量組用終濃度為1、10、100 μmol/L GEN溶液[7]處理細胞后,置于終濃度為3 mmol/L METH溶液的無FBS培養基繼續培養24 h;陽性對照組用含終濃度為20 μmol/L阿立哌唑溶液[3]處理細胞后,置于終濃度為3 mmol/L METH溶液的無FBS培養基繼續培養24 h。所有實驗重復6次。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖能力 將細胞以2.5×105/mL密度接種至24孔板,繼續培養24 h,各孔加MTT(20 μL,5 g/L),繼續培養4 h后,加入5 mg/mL濃度的二甲基亞砜溶液150 μL,振蕩、溶解。測定490 nm處各孔細胞光密度值(OD490 nm),細胞存活率即為各試驗孔OD值占空白對照組OD值的百分比。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 收集各組細胞,按照凋亡試劑盒說明書,以5 μL碘化丙啶(PI)+5 μL異硫氰酸熒光黃(AnnexinV-FITC)雙染試劑,避光孵育20～25 min、稀釋后,1 h內上機檢測,儀器讀取凋亡率數值。

1.2.4 ELISA檢測氧化應激水平 收集各組細胞及上清液,加入裂解液后立即根據ROS試劑盒說明書檢測待測樣本ROS含量;取上清8 000 r/min,離心15 min,采用SOD、MDA試劑盒檢測待測樣本SOD、MDA含量。

1.2.5 免疫印跡法檢測Nrf2/HO-1通路相關蛋白表達情況 收集各組細胞,裂解,提取總蛋白,行電泳,轉膜,加入封閉液25℃封閉2 h,加入一抗Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、內參β-actin(1∶500),4℃過夜,加入HRP標記二抗(1∶1 000稀釋),25℃孵育1.5 h,顯影、定影,計算目的蛋白與內參β-actin的相對表達量。

2 結果

2.1 各組PC12細胞增殖情況比較與空白對照組比較,METH組PC12細胞存活率降低(P<0.05);與METH組比較,GEN低、中、高劑量組及陽性對照組PC12細胞存活率升高(P<0.05);與陽性對照組比較,GEN低、中劑量組PC12細胞存活率降低(P<0.05),GEN高劑量組PC12細胞存活率差異無統計學意義(P>0.05);PC12細胞存活率呈劑量依賴性升高(P<0.05),見表1。

表1 各組PC12細胞增殖抑制率比較

2.2 各組PC12細胞凋亡情況比較與空白對照組比較,METH組PC12細胞凋亡率升高(P<0.05);與METH組比較,GEN低、中、高劑量組及陽性對照組PC12細胞凋亡率降低(P<0.05);與陽性對照組比較,GEN低、中劑量組PC12細胞凋亡率升高(P<0.05),GEN高劑量組PC12細胞凋亡率差異無統計學意義(P>0.05);PC12細胞凋亡率呈劑量依賴性降低(P<0.05),見圖1、表2。

注:A,空白對照組;B,METH組;C,GEN低劑量組;D,GEN中劑量組;E,GEN高劑量組;F,陽性對照組。圖1 各組PC12細胞凋亡情況比較

表2 各組PC12細胞凋亡情況比較

2.3 各組PC12細胞氧化應激水平比較與空白對照組比較,METH組PC12細胞SOD活性降低,MDA含量、ROS水平均升高(P<0.05);與METH組比較,GEN低、中、高劑量組及陽性對照組SOD活性升高,MDA含量、ROS水平降低(P<0.05);與陽性對照組比較,GEN低、中劑量組SOD活性降低,MDA含量、ROS水平升高(P<0.05);GEN高劑量組SOD、MDA、ROS差異無統計學意義(P>0.05);SOD活性呈劑量依賴性升高,MDA含量、ROS水平呈劑量依賴性降低(P<0.05),見表3。

表3 各組PC12細胞氧化應激水平比較

2.4 各組PC12細胞凋亡蛋白表達比較與空白對照組比較,METH組Bax蛋白水平升高,Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05);與METH組比較,GEN低、中、高劑量組及陽性對照組Bax蛋白水平降低,Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05);與陽性對照組比較,GEN低、中劑量組Bax蛋白水平升高,Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05),GEN高劑量組Bax、Bcl-2蛋白水平差異無統計學意義(P>0.05);Bax蛋白水平呈劑量依賴性降低,Bcl-2蛋白水平呈劑量依賴性升高(P<0.05),見表4。

表4 各組PC12細胞凋亡蛋白表達比較

2.5 PC12細胞Nrf2/HO-1通路蛋白表達比較與空白對照組比較,METH組PC12細胞Nrf2、HO-1蛋白水平降低(P<0.05);與METH組比較,GEN低、中、高劑量組和陽性對照組Nrf2、HO-1蛋白水平升高(P<0.05);與陽性對照組比較,GEN低、中劑量組Nrf2、HO-1蛋白水平降低(P<0.05),GEN高劑量組Nrf2、HO-1蛋白水平差異無統計學意義(P>0.05);Nrf2、HO-1蛋白水平呈劑量依賴性升高(P<0.05),見表5。

表5 各組PC12細胞Nrf2/HO-1通路蛋白表達比較

3 討論

METH俗稱"冰毒",無色、無臭,屬于苯丙胺類中樞神經興奮劑。METH極易透過血腦屏障并選擇性作用于中樞神經系統損害中樞神經,造成幻聽、幻視等精神分裂陽性癥狀及沖動、焦慮等,給濫用者身體及精神造成嚴重傷害,甚至造成刑事犯罪,危害社會公共安全[8]。阿立哌唑屬于脂溶性喹諾啉酮類衍生物,是一種抗精神病藥物。研究顯示,阿立哌唑對神經細胞損傷具有保護作用,但也具有一定的副作用[9]。因此尋找有效且副作用少的戒毒藥物具有重要社會意義。GEN是一種三羥基異黃酮,其在細胞缺血再灌注損傷修復、氧化應激調控中的作用日益受到關注[10]。研究顯示[11],GEN對叔丁基過氧化氫誘導的心肌細胞H9c2衰老模型有顯著的保護作用,其機制與提高細胞的抗氧化能力有關。高華武等[12]研究發現,GEN可通過調控鈣離子通道相關蛋白表達,促進海馬神經元損傷修復進程。引發神經元細胞凋亡是METH神經毒性作用機制之一[13]。多項研究證實,Bcl-2和Bax參與腦神經細胞損傷,且可受機體內的ROS、DNA損傷等氧化應激因素刺激,使Bax與Bcl-2表達失衡,參與調控神經細胞凋亡[14-15]。本研究以不同劑量GEN處理后,PC12細胞存活率升高,凋亡率降低,且Bax蛋白下調,Bcl-2蛋白上調,且具有劑量依賴性,高劑量組與陽性對照組無差異,說明GEN可能促進METH誘導的PC12細胞增殖并抑制細胞凋亡,對神經細胞損傷發揮保護作用。

多巴胺神經元氧化應激損傷可能是METH細胞毒作用機制之一[16]。本研究以不同劑量GEN處理后,PC12細胞SOD活性升高,MDA、ROS水平降低,呈劑量依賴性。SOD與MDA水平可間接反映細胞氧化應激損傷程度[17-18]。龔曉康等[19]研究顯示,METH可促進小鼠腦區氧化應激損傷學習記憶,其在動物體內水平的研究結果與本研究一致。說明GEN可能通過抑制METH誘導的氧化應激損傷,進而促進PC12細胞增殖并抑制凋亡。范勇等[20]研究發現,GEN可通過調控海馬神經元自噬水平保護創傷應激障礙大鼠神經損傷,但具體機制尚不明確。Nrf2是一種抗氧化劑,當氧化應激信號刺激組織器官時,Nrf2轉移至細胞核與下游的多效靶基因相結合發生轉錄反應,產生HO-1、SOD等抗氧化物酶,能夠有效清除細胞內的氧自由基,進而抑制細胞氧化應激損傷導致的細胞凋亡[21]。林斯革等[22]研究顯示,促進Nrf2/HO-1通路活化可對腦缺血再灌注后神經元損傷發揮保護作用。本研究以不同劑量GEN處理后的PC12細胞Nrf2、HO-1蛋白水平升高,呈劑量依賴性,高劑量組與陽性對照組無差異。說明GEN能促進METH誘導的PC12細胞增殖并抑制細胞凋亡,對神經細胞發揮保護作用,可能是通過促進Nrf2/HO-1通路活化抑制氧化應激損傷實現的。

綜上所述,GEN能促進METH誘導的PC12細胞增殖并抑制細胞凋亡,可能對神經細胞發揮保護作用,且可能與促進Nrf2/HO-1通路活化抑制氧化應激損傷有關。然而本研究并未能明確Nrf2/HO-1通路在METH誘導的PC12細胞損傷中的具體作用機制,后期有待進一步研究。