重組人生長激素促進(jìn)糖尿病模型大鼠創(chuàng)面愈合的機(jī)制研究

曹 強(qiáng), 劉小龍

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院燒傷創(chuàng)面修復(fù)外科, 烏魯木齊 830001)

糖尿病足(Diabetic foot,DF)是糖尿病較為常見的并發(fā)癥之一,其病情復(fù)雜,往往造成患者殘疾甚至死亡[1],給患者身心帶來傷害,也給其家庭和社會(huì)帶來沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。超過1/4的糖尿病患者自患病起就終生面臨DF的風(fēng)險(xiǎn),因此早期正規(guī)治療潰瘍創(chuàng)面,促進(jìn)愈合成為有效降低DF患者致殘甚至死亡的重要手段[3]。重組人生長激素(Recombinant human growth hormone,rhGH)近年來臨床研究較多,就創(chuàng)面修復(fù)而言,它可以通過促進(jìn)創(chuàng)面炎癥細(xì)胞聚積,表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及巨噬細(xì)胞分裂增殖,從而加速創(chuàng)面修復(fù),尤其在燒傷領(lǐng)域應(yīng)用較廣[4-6],并取得較好效果。鑒于其用于治療燒傷創(chuàng)面過程中具有一定的升高血糖的副作用[7],將其應(yīng)用于DF患者的研究報(bào)道較少。本團(tuán)隊(duì)前期研究表明,將小劑量(0.2～0.6 IU/kg) rhGH以創(chuàng)周點(diǎn)狀注射的方式應(yīng)用于2型糖尿病(T2DM)模型大鼠背部創(chuàng)面,不僅可有效促進(jìn)創(chuàng)面愈合,縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間,且對(duì)血糖無明顯影響[8]。因此,本文擬進(jìn)一步探索rhGH促進(jìn)T2DM模型大鼠創(chuàng)面愈合的機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料健康成年SPF級(jí)Wistar大鼠35只,體重180～220 g,雄性,純系,購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[許可證號(hào):SCXK(京)2019-0010)]。白蛋白(ALB)測(cè)定試劑盒(南京建成科技有限公司),鼠酸性成纖維生長因子(aFGF)試劑盒、鼠血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)試劑盒、鼠表皮細(xì)胞生長因子(EGF)試劑盒、鼠胰島素樣生長因子-1(IGF-1)試劑盒(均購自江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司),小動(dòng)物麻醉機(jī)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司),動(dòng)物飼料(江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程責(zé)任有限公司),鏈脲佐菌素配制液(阿拉丁試劑上海晶純?cè)噭┯邢薰?,注射用重組人生長激素(賽增)(長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司,生產(chǎn)批號(hào):201905029)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 T2DM大鼠建模 35只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,選取28只連續(xù)4周喂養(yǎng)高糖高脂飼料(配比:普通鼠飼料∶豬油∶蔗糖∶膽固醇=79∶10∶10∶1),第6周開始隔天腹腔注射鏈脲佐菌素溶液(50 mg/kg),共3次,檢測(cè)空腹血糖(禁食12 h不禁水),鼠尾末梢血空腹血糖>11.1 mmol/L為T2DM大鼠建模成功。28只大鼠均建模成功。

1.2.2 創(chuàng)面建模 28只T2DM大鼠及7只正常大鼠脫毛、麻醉后切取背部2 cm×2 cm全層皮膚,共同建立創(chuàng)面模型。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組和用藥 對(duì)照組:7只正常大鼠的背部創(chuàng)面在每日換藥過程中,創(chuàng)周點(diǎn)狀注射1 mL 0.9%生理鹽水2周。28只T2DM創(chuàng)面模型大鼠分為4組,每組7只。(1)模型+鹽水組:每日創(chuàng)面換藥過程中創(chuàng)周點(diǎn)狀注射1 mL 0.9%生理鹽水2周;(2)GH2組:每日創(chuàng)面換藥過程中創(chuàng)周點(diǎn)狀注射生理鹽水稀釋后的rhGH(rhGH劑量為0.2 IU/kg)1 mL,持續(xù)2周;(3)GH4組:每日創(chuàng)面換藥過程中創(chuàng)周點(diǎn)狀注射生理鹽水稀釋后的rhGH(rhGH劑量為0.4 IU/kg) 1 mL,持續(xù)2周;(4)GH6組:每日創(chuàng)面換藥過程中創(chuàng)周點(diǎn)狀注射生理鹽水稀釋后的rhGH(rhGH劑量為0.6 IU/kg)1 mL,持續(xù)2周。此后每日常規(guī)創(chuàng)面換藥至創(chuàng)面愈合。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)和標(biāo)本收集各組分別于干預(yù)第0、14 d時(shí)取鼠尾末梢血,用于檢測(cè)aFGF、VEGF、EGF、IGF-1、ALB的水平。

2 結(jié)果

2.1 各組干預(yù)前后血清aFGF水平比較除模型+鹽水組外,其余各組內(nèi)干預(yù)后14 d aFGF水平均較干預(yù)前升高(P<0.05);干預(yù)后14 d,與對(duì)照組相比,模型+鹽水組aFGF水平降低(P<0.05);GH6組aFGF水平明顯升高,與模型+鹽水、GH2、GH4組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 各組干預(yù)前后血清aFGF水平比較

2.2 各組干預(yù)前后血清VEGF水平比較各組內(nèi)干預(yù)后14 d VEGF水平均較干預(yù)前升高(P<0.05);干預(yù)后14 d,與對(duì)照組相比,模型+鹽水組VEGF水平降低(P<0.05);GH6組VEGF水平明顯升高,但與模型+鹽水、GH2、GH4組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 各組干預(yù)前后血清VEGF水平比較

2.3 各組干預(yù)前后血清EGF水平比較各組內(nèi)干預(yù)后14 d,EGF水平均較干預(yù)前升高(P<0.05);干預(yù)后14 d,與對(duì)照組相比,模型+鹽水組EGF水平降低(P<0.05);GH4組EGF水平明顯升高,但與模型+鹽水、GH2、GH6組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表3 各組干預(yù)前后血清EGF水平比較

2.4 各組干預(yù)前后血清IGF-1水平比較各組內(nèi)干預(yù)后14 d,IGF-1水平均較干預(yù)前升高(P<0.05);干預(yù)后14 d,與對(duì)照組相比,模型+鹽水組IGF-1水平降低(P<0.05);GH6組IGF-1水平明顯升高,與模型+鹽水組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表4。

表4 各組干預(yù)前后血清IGF-1水平比較

2.5 各組干預(yù)前后血清ALB水平比較各組內(nèi)干預(yù)后14 d, ALB水平均較干預(yù)前升高(P<0.05);干預(yù)后14 d,與對(duì)照組相比,模型+鹽水組ALB水平降低(P<0.05);GH6組ALB水平明顯升高,與模型+鹽水、GH2、GH4組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表5。

表5 各組干預(yù)前后血清ALB水平比較

3 討論

創(chuàng)面愈合過程主要由炎癥反應(yīng)期、修復(fù)增殖期和創(chuàng)面重塑期三個(gè)相互重疊組成[9]。該過程由許多生長因子參與調(diào)控,如FGF、VEGF、EGF、IGF-1等等[10]。本研究通過檢測(cè)這些生長因子干預(yù)前后的表達(dá)水平來間接探索rhGH促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的機(jī)制。其中,FGF最早是從牛垂體中提取獲得[11],有兩個(gè)亞型,即酸性成纖維生長因子(aFGF)和堿性成纖維生長因子(bFGF),其中aFGF是細(xì)胞增殖和分化的有效促進(jìn)因子[12]。炎癥期,它可以趨化炎癥細(xì)胞并加速其增殖、分化;增殖期,它可以直接促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化,加速肉芽組織形成,同時(shí)還可以促進(jìn)膠原蛋白的合成、分泌和沉積,另外,它還能直接促進(jìn)毛細(xì)血管再生[13]。VEGF一度被認(rèn)為是特異性很高的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原,現(xiàn)已成為研究最為廣泛的血管生成刺激物[13]。炎癥期,它可以增加血管通透性,加速清除壞死組織;增殖期,可促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織形成[14]。EGF最早是在研究神經(jīng)生長因子時(shí)被發(fā)現(xiàn),炎癥期其生理作用與aFGF和VEGF類似;增殖期,它可以加速創(chuàng)面毛細(xì)血管再生,并促進(jìn)膠原蛋白、糖胺聚糖的合成,同時(shí)促進(jìn)創(chuàng)面膠原蛋白的沉積和纖維結(jié)締組織增生;創(chuàng)面修復(fù)中晚期,它可以促進(jìn)創(chuàng)面上皮化,加速創(chuàng)面收縮,還可以調(diào)節(jié)創(chuàng)面拉伸強(qiáng)度[15-16]。IGF-1最早是在研究生長激素過程中被發(fā)現(xiàn)[17]。炎癥期,其處于低水平狀態(tài);增殖期,它可加速創(chuàng)面肉芽化;重塑期,其表達(dá)達(dá)到高峰[18]直接加速創(chuàng)面上皮化并增加其強(qiáng)度。另外,ALB作為評(píng)價(jià)營養(yǎng)狀態(tài)的重要指標(biāo),在創(chuàng)面愈合中也起著至關(guān)重要的作用,它不僅能夠維持正常生理功能,也能為創(chuàng)面修復(fù)提供底物,故而也被列入檢測(cè)指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示,各組大鼠干預(yù)14 d后,血清中aFGF(除模型+鹽水組)、VEGF、EGF、IGF-1、ALB水平均較干預(yù)前明顯升高,說明創(chuàng)面形成后,大鼠機(jī)體通過提高上述因子分泌水平啟動(dòng)創(chuàng)面修復(fù)過程。 rhGH干預(yù)14 d后,GH6組大鼠血清aFGF和ALB水平明顯高于模型+鹽水、GH2和GH4組,說明此濃度的rhGH療效最好,與本團(tuán)隊(duì)前期研究[8]結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn),rhGH干預(yù)14 d后,T2DM大鼠各組間血清VEGF和EGF表達(dá)水平無明顯差異,分析原因如下:(1)在一項(xiàng)探討白藜蘆醇促進(jìn)受損骨骼肌恢復(fù)的作用機(jī)制研究中,發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性生長因子在外源性干預(yù)下表達(dá)峰值出現(xiàn)在干預(yù)后7 d,而本研究干預(yù)后采樣點(diǎn)選擇了第14天,而此時(shí)諸生長因子表達(dá)有所下降并逐漸趨于平穩(wěn)[19];(2)本研究由于經(jīng)費(fèi)有限,樣本量較小的問題較為突出,在更大樣本的研究中結(jié)果可能會(huì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;(3)本研究樣本測(cè)量的方法為采取鼠尾血,即測(cè)量的是全身生長因子水平,不除外VEGF、EGF創(chuàng)面局部表達(dá)濃度高的可能,目前尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于此類生長因子局部和全身表達(dá)差異的研究尤其是T2DM患者此方面的研究,此設(shè)想需在未來研究中進(jìn)一步推理論證;(4)rhGH通過提高相應(yīng)的生長因子表達(dá)水平從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合,諸多因子還包括本研究尚未涉及的血小板衍生生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)等,VEGF、EGF等因子表達(dá)雖有增高但未達(dá)質(zhì)變水平,可能并非是rhGH的主要“驅(qū)動(dòng)目標(biāo)”;(5)為避免大劑量用藥導(dǎo)致T2DM模型大鼠血糖水平升高,本研究采用小劑量用藥,可能尚不足以明顯刺激VEGF、EGF大量表達(dá)。

綜上,本研究顯示0.6 IU/kg rhGH明顯提高了T2DM大鼠創(chuàng)面形成后aFGF、IGF-1的表達(dá)水平,促進(jìn)了ALB的合成,至于PDGF、TGF等其他生長因子是否也會(huì)在此濃度rhGH的刺激下大幅提高表達(dá)水平進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合,尚需進(jìn)一步研究。