血脂相關(guān)基因DNA甲基化水平與冠心病的關(guān)聯(lián)性研究

劉 帥, 魏 嫻, 李 洋, 付真彥, 馬依彤

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟中心, 烏魯木齊 830054)

冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)是造成死亡的主要因素。每年因CAD導(dǎo)致的死亡人數(shù)超過900萬[1]。2002-2014年在中國進(jìn)行的一項(xiàng)大規(guī)模流行病學(xué)研究中,成人血脂異常的總體患病率顯著增加,降低血脂異常的患病率可以顯著降低心血管疾病的患病率[2]。因此探究血脂異常的發(fā)病機(jī)制,并對(duì)其進(jìn)行有效干預(yù),可以降低心血管疾病的患病率。

血脂異常是環(huán)境和遺傳相互作用的結(jié)果。研究表明,遺傳因素會(huì)影響總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。然而,即使考慮到罕見突變的原因,已知的基因變異也只能解釋10%～25%的血脂異常。這表明基因和環(huán)境之間的相互作用不能完全解釋血脂異常的發(fā)病機(jī)制[3]。

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的一種重要形式。DNA甲基化主要發(fā)生在高等動(dòng)物中,并在不改變?cè)蓟驂A基序列的情況下影響基因表達(dá)。目前,DNA甲基化是脂質(zhì)代謝領(lǐng)域研究最多的表觀遺傳學(xué)研究[4]。多項(xiàng)研究表明,關(guān)鍵基因的甲基化特征可能在冠心病的發(fā)展中起作用[5-7],然而在血脂異常中的作用尚不清楚。本研究選取了參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程的低密度脂蛋白受體(LDLR)、前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin9(PCSK9)、肌球蛋白調(diào)控輕鏈結(jié)合蛋白(MYLIP)、低密度脂蛋白受體銜接蛋白1(LDLRAP1)、淀粉樣β前體樣蛋白2(APLP2)、DAB受體蛋白2(DAB2)、類NPC1細(xì)胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(NPC1L1)、LIM結(jié)構(gòu)域和肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白1(LIMA1),以及新發(fā)現(xiàn)的與膽固醇合成相關(guān)的基因如泛素特異肽酶11和20(USP11和USP20)。這些基因的DNA甲基化是否與冠心病直接相關(guān)尚不清楚。有研究表明GRINA基因的DNA甲基化與冠心病相關(guān)[8],也有研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因ANGPTL4、APOC3、APOA5、APOB等與冠心病相關(guān)[9]。本研究通過分析病例組和對(duì)照組中與血脂相關(guān)基因的DNA甲基化水平表達(dá)差異,來探討這些基因的DNA甲基化與冠心病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料在開始研究之前,本課題組根據(jù)赫爾辛基宣言制定了研究策略,并通過了新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理審查委員會(huì)的倫理審核(20070726-8)。2012-2015年在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院招募35名冠心病患者作為病例組,35名正常者作為對(duì)照組。所有參與者都簽署了知情同意書。收集的信息包括年齡、性別、高血壓史、糖尿病史、吸煙史等。冠心病患者選取標(biāo)準(zhǔn):由1～3名至少為主治醫(yī)師的心血管內(nèi)科醫(yī)師進(jìn)行評(píng)估,當(dāng)造影結(jié)果顯示超過一支冠狀動(dòng)脈血管狹窄程度超過50%被認(rèn)定為患有冠心病。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并急性心力衰竭、惡性心律失常或心臟瓣膜病等其他心臟病患者;(2)合并嚴(yán)重腦血管、肝、腎、肺組織疾病患者;(3)合并全身性傳染病、惡性腫瘤或甲狀腺疾病患者;(4)合并血液、免疫、內(nèi)分泌、神經(jīng)系統(tǒng)或嚴(yán)重精神疾病患者。

1.2 血樣采集及處理所有參與者禁食過夜后,于清晨7時(shí)抽取外周血,置于EDTA(乙二胺四乙酸)抗凝管中。在測(cè)序和分析DNA甲基化之前,使用商業(yè)試劑盒(北京天根)從外周血中提取DNA,并用75%乙醇稀釋。將收取的血液樣本進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)和甲基化分析。

1.3 目標(biāo)序列確定本研究選擇LDLR、PCSK9、MYLIP等10個(gè)基因中的CpG島進(jìn)行DNA甲基化水平檢測(cè)。選取標(biāo)準(zhǔn)如下:(1)片段最短長度為200 bp;(2)GC含量至少50%;(3)實(shí)際的核苷酸CpG島與預(yù)期的CpG島的比率高于0.60。最終選取結(jié)果見表1,引物設(shè)計(jì)見表2。

表1 各基因CpG島片段數(shù)量情況

表2 引物設(shè)計(jì)

1.4 DNA甲基化水平檢測(cè)使用EZ DNA MethylationTM-GOLD試劑盒(ZYMO RESEARCH,美國加利福尼亞州),根據(jù)試劑盒說明書對(duì)基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。使用HotStarTaq聚合酶試劑盒(TAKARA,日本東京)對(duì)目標(biāo)CpG島進(jìn)行PCR擴(kuò)增并構(gòu)建文庫后,將產(chǎn)物在Illumina MiSeq臺(tái)式測(cè)序儀(CA,美國)上進(jìn)行測(cè)序。所有樣本的平均覆蓋率均高于600倍。檢測(cè)的CpG區(qū)域定義為CpG位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)之間的距離(以bp為單位)。CpG位點(diǎn)甲基化水平定義為甲基化胞嘧啶/全胞嘧啶比率。基因甲基化水平定義為所有檢測(cè)到的CpG位點(diǎn)的平均甲基化水平。

2 結(jié)果

2.1 病例組與對(duì)照組基線資料比較由于DNA甲基化程度與性別和年齡顯著相關(guān),本研究中病例組和對(duì)照組在性別和年齡上的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表明研究方案是可行的。兩組間的總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、血糖、糖化血紅蛋白、肌酐水平以及吸煙分布上的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),見表3。

表3 病例組與對(duì)照組基線資料比較

2.2 各基因CpG甲基化位點(diǎn)分析本研究共計(jì)檢測(cè)了10個(gè)基因中的321個(gè)CpG位點(diǎn),其中LDLR有13個(gè),PCSK9有38個(gè),MYLIP有31個(gè),LDLRAP1有35個(gè),APLP2有70個(gè),DAB2有12個(gè),NPC1L1有8個(gè),LIMA1有32個(gè),USP11有34個(gè),USP20有48個(gè)。在這些CpG位點(diǎn)中,兩組DNA甲基化表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的共計(jì)10個(gè),見表4。

表4 病例組與對(duì)照組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的CpG位點(diǎn)

2.3 各基因甲基化整體分析將10個(gè)基因的每個(gè)CpG位點(diǎn)進(jìn)行分析,將整個(gè)基因全部CpG位點(diǎn)的DNA甲基化平均水平定義為該基因DNA甲基化整體水平,發(fā)現(xiàn)本研究中的10個(gè)基因整體水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表5。

表5 病例組與對(duì)照組間基因的平均甲基化水平差異

2.4 CpG位點(diǎn)甲基化單倍型分析本研究對(duì)不同基因的DNA甲基化單倍型進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的甲基化單倍型共26個(gè),見表6。

表6 病例組與對(duì)照組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的甲基化單倍型

3 討論

冠心病是一種受環(huán)境和遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素影響的復(fù)雜疾病。血脂異常是冠心病的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。DNA甲基化是研究最廣泛的表觀遺傳機(jī)制,在人類疾病的病因中起著重要作用。研究表明,基因啟動(dòng)子中的DNA甲基化變化可能與冠心病的發(fā)展有關(guān)[10-11]。本研究結(jié)果顯示冠心病患者和對(duì)照受試者中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的DNA甲基化水平存在差異,這些結(jié)果支持脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表觀遺傳變化可能引起血脂譜的變異,從而影響冠心病的發(fā)生發(fā)展。

在膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)方面,膽固醇由血液循環(huán)運(yùn)輸至肝臟后,經(jīng)肝細(xì)胞表面LDLR內(nèi)吞進(jìn)入肝細(xì)胞。LDLRAP1是調(diào)控LDLR介導(dǎo)的LDL-C內(nèi)吞過程中最主要的銜接蛋白。LDL-C與肝細(xì)胞質(zhì)膜上的LDLR結(jié)合后,LDLRAP1和Dab2蛋白特異性識(shí)別并結(jié)合LDLR尾部的NPXY/F 內(nèi)吞信號(hào)序列,誘導(dǎo)LDLR/LDL-C復(fù)合體內(nèi)吞至溶酶體中降解,促使血液LDL-C水平降低。MYLIP也可以促進(jìn)LDLR至溶酶體降解,而PCSK9與LDL競(jìng)爭性地結(jié)合肝細(xì)胞表面的LDLR,PCSK9/LDLR復(fù)合物進(jìn)入肝細(xì)胞到達(dá)溶酶體降解LDLR,降低了肝細(xì)胞表面的LDLR。研究表明PCSK9是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的重要蛋白質(zhì),PCSK9通過調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化前因子的活性在動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[12-13]。APLP2是淀粉樣前體蛋白(APP)家族中的一員,APP 家族成員包括APP、APLP1和APLP2,研究者們最初在阿爾茨海默病患者中發(fā)現(xiàn)該家族。APLP2被認(rèn)為是膽固醇代謝重要候選基因,APLP2通過與PCSK9、APOE等相互作用來調(diào)節(jié)血液中膽固醇水平[14]。在膽固醇的吸收方面,食物和膽汁中的膽固醇在小腸的中上端被人體吸收。食物中的膽固醇受到小腸黏膜上皮細(xì)胞NPC1L1信號(hào)通路調(diào)控。NPC1L1發(fā)揮的功能主要是借助囊泡內(nèi)吞機(jī)制介導(dǎo)膽固醇吸收。LIMA1蛋白可以介導(dǎo)NPC1L1蛋白和myosin Vb蛋白相互作用,參與NPC1L1蛋白的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn),從而影響其對(duì)膽固醇的內(nèi)吞作用[15]。在膽固醇合成方面,USP11與USP20被發(fā)現(xiàn)會(huì)通過mTORC途徑進(jìn)而影響膽固醇合成[16]。本研究發(fā)現(xiàn)APLP2中的3個(gè)CpG位點(diǎn)、LDLR中的1個(gè)CpG位點(diǎn)、LIMA1中的2個(gè)CpG位點(diǎn)、USP20中的4個(gè)CpG位點(diǎn)與冠心病相關(guān)。本研究通過檢測(cè)整個(gè)CpG片段來檢測(cè)DNA甲基化水平,不僅檢測(cè)到了CpG位點(diǎn),還檢測(cè)到了整體CpG域甲基化與冠心病之間的關(guān)系。

DNA甲基化是一種轉(zhuǎn)錄前修飾,涉及在核苷酸上精確添加甲基。DNA甲基化通過與修飾的核小體蛋白相互作用調(diào)節(jié)基因表達(dá)并保持基因組完整性[17]。基因組中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)周圍的CpG島在某些階段分布不同。通常,DNA甲基化結(jié)合CG甲基化抑制基因表達(dá)。啟動(dòng)子區(qū)域甲基化可能通過兩種方式抑制基因轉(zhuǎn)錄。首先,物理分離轉(zhuǎn)錄元件和基因啟動(dòng)子復(fù)合物。第二,組蛋白或染色質(zhì)修飾劑與甲基CpG結(jié)合域結(jié)合,從而激活抑制機(jī)制并導(dǎo)致染色質(zhì)緊皺[18]。甲基化CpG島是基因抑制的生物學(xué)指標(biāo),因?yàn)槠涔δ苁羌谆Y(jié)合蛋白的對(duì)接位點(diǎn),它們可以主要抑制基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄成分,招募轉(zhuǎn)錄抑制劑,并阻止激活蛋白結(jié)合[19]。在課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)TBL2基因的DNA甲基化水平與超低密度脂蛋白膽固醇血癥相關(guān)[20]。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)與血脂代謝相關(guān)基因的CpG位點(diǎn)的DNA甲基化與冠心病相關(guān),可以為冠心病的預(yù)防和治療提供一些思路。本研究還發(fā)現(xiàn)多個(gè)單倍型與冠心病有關(guān),這些位點(diǎn)將來可能會(huì)用于冠心病的早期篩查。另外,這是一項(xiàng)隨機(jī)病例對(duì)照研究,是從人類受試者得到的研究結(jié)論,具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。同時(shí),這項(xiàng)研究也有局限性。首先,本研究是一項(xiàng)相關(guān)性研究,需要進(jìn)一步的功能研究來解釋這些基因DNA甲基化與冠心病之間的分子機(jī)制。其次,這是一項(xiàng)單中心研究,可能會(huì)限制研究結(jié)果的普遍性。