糖尿病因素削弱右美托咪定對腎缺血再灌注后心肌損傷的保護作用

耿 強, 伊合山·艾尼瓦爾, 張靜靜, 祖力亞爾·吾斯曼, 南 樂, 張 冰

(新疆醫科大學1第三臨床醫學院, 2附屬腫瘤醫院麻醉科, 烏魯木齊 830011)

糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是由于氧化應激、胰島素抵抗引起的一系列代謝綜合征[1],其患病率呈現快速增長的態勢[2]。糖尿病靶器官損害是導致糖尿病患病人群死亡的重要誘因。研究表明,罹患糖尿病后心肌損傷的敏感性增高[3]。

本課題組前期研究發現[4],腎缺血再灌注損傷(Renalischemia-reperfusioninjury,RI/RI)能夠激活核因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)誘發心肌損害,而右美托咪定預處理(Dexmedetomidinepreconditioning,DP)能夠為其提供有效的心肌保護,炎癥機制是其中心環節[5],但在2型糖尿病背景下右美托咪定對心肌保護作用的有效性以及是否涉及炎癥機制目前尚未明確。本研究擬通過制備2型糖尿病大鼠腎缺血再灌注(RIR)后心肌損傷模型,并與非2型糖尿病大鼠模型對比,探究糖尿病因素削弱右美托咪定對RIR后心肌保護的炎癥機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備及分組SPF級健康雄性Wistar大鼠,12周齡,體重200～300 g,由新疆醫科大學動物實驗中心提供,本實驗經新疆醫科大學實驗動物倫理委員會審查批準實施(審批號:IACUC-20220306-05)。大鼠均飼養在屏障環境中,自由攝食飲水。

取Wistar大鼠30只,適應性飼養后給予45%高糖高脂飼料喂養4 w。禁食12 h,腹腔注射1%鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg,72 h后測量隨機血糖。若出現隨機血糖≥16.7 mmol/L以及多飲、多尿、體重減少癥狀則認為2型糖尿病模型建模成功。

在構建大鼠2型糖尿病模型期間有6只大鼠死亡,故24只大鼠建模成功,隨機分為模型+鹽水組(DM-C組)、模型+腎缺血再灌注組(DM-IR組)和模型+右美托咪定預處理組(DM-DP組)。另取24只非2型糖尿病大鼠作為對照并隨機分為正常+鹽水組(NDM-C組)、正常+腎缺血再灌注組(NDM-IR組)和正常+右美托咪定預處理組(NDM-DP組)。(1)模型+鹽水組和正常+鹽水組大鼠只開腹,尾靜脈泵注等量生理鹽水;(2)腎缺血再灌注處理:術前禁食8 h,不禁水,稱重。腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉后固定,沿腹白線開腹約5 cm,暴露腹腔。分離并切除右腎,再暴露左腎及腎蒂,分離左腎動脈,以動脈夾夾閉左腎動脈,可見左腎顏色由鮮紅變為暗紅,則腎缺血成功,缺血45 min后恢復動脈血供,若腎臟顏色逐漸由暗紅變成鮮紅色表明腎缺血再灌注建模成功,尾靜脈持續泵注等量生理鹽水。操作完成后關閉腹腔,持續體外加溫并計時。(3)右美托咪定預處理:開放尾靜脈通路后,按體表面積法,以2 μg·kg-1·h-1的速率于缺血前30 min起泵注至再灌注結束后4 h。

1.2 主要藥品及試劑鹽酸右美托咪定注射液(批號:21051531,揚子江藥業集團有限公司,中國),鏈脲佐菌素STZ(CAS號:18883-66-4,Sigma,美國),45%高脂飼料(45%脂肪、0.2%膽固醇),檸檬酸鈉緩沖液(批號:C1013,Solarbio,中國),肌鈣蛋白I(cTnI)(華美,中國),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(聯科,中國),白介素-17a(IL-17a)(聯科,中國),白介素-10(IL-10)(聯科,中國),核因子-κB(NF-κB p65)(博奧森,中國),p-NF-κB p65 (Ser536) (博奧森,中國),β-actin(義翹神州,中國)。

1.3 標本采集再灌注結束后,將大鼠背部墊高,開腹,游離腹主動脈,使用靜脈采血針留取血標本。同時,利用失血性休克法處死大鼠后,開胸分離心臟,沿主動脈根部剪下心臟,置入4℃PBS中清洗干凈,留取左心室,分裝如凍存管后置入液氮中保存。每組中隨機選取3例進行后續檢測。

1.4 ELISA法檢測血清中cTnI、IL-17a、IL-10水平將血標本混勻、靜置30 min,離心(2 000 r/min,15 min,4 ℃)后取上清,采用ELISA法測定血清中cTnI、IL-17a、IL-10水平。

1.5 TUNEL染色觀察心肌組織凋亡水平并計算凋亡率使用TUNEL凋亡檢測試劑盒-POD進行TUNEL分析以評估細胞凋亡。心肌組織使用甲醛溶液固定并包埋在石蠟中,將組織切成5 μm切片進行TUNEL染色。通過在生物顯微鏡下觀察并以盲法計算和分析每個高倍視野的TUNEL陽性細胞數,計算凋亡率。

1.6 Western blot法檢測心肌組織中NF-κBp65的表達及磷酸化水平心肌組織樣本經液氮研磨后,加入400 μL RIPA裂解液,充分混勻。4℃靜置60 min后,4℃離心15 min并收集上清,采用BCA法對所提蛋白定量,考馬斯亮藍染色。使用5×SDS-PAGE電泳,轉入PVDF膜上,加入5%脫脂奶粉的封閉液,封閉轉印膜1 h。加入TBST稀釋一抗(稀釋度1∶400,博奧森公司),4℃孵育過夜。TBST洗膜3次,加入山羊抗兔IgGHRP(稀釋度1∶5 000,Abcam公司),室溫孵育1 h。TBST洗膜3次。將顯色液A液和B液混勻,取2 mL加至膜上。使用Chemiscope 3000檢測、拍照。通過ChemiAnalysis軟件計算得到條帶灰度值,利用目的蛋白與內參蛋白的比例計算得到蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 各組大鼠血清cTnI水平比較與NDM-C組比較,NDM-IR組cTnI水平升高(P<0.05);與NDM-IR組比較,NDM-DP組cTnI水平降低(P<0.05);與DM-C組比較,DM-IR組和DM-DP組cTnI水平均升高(P<0.05);與DM-IR組比較,DM-DP組cTnI水平降低(P<0.05);與NDM-DP組比較,DM-DP組cTnI水平升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清cTnI水平比較

2.2 各組大鼠血清IL-17a、IL-10水平比較與NDM-C組比較,NDM-IR組IL-17a水平升高、IL-10水平降低(P<0.05);與NDM-IR組比較,NDM-DP組IL-17a水平降低、IL-10水平升高(P<0.05);與DM-C組比較,DM-IR組和DM-DP組IL-17a水平均升高、IL-10水平均降低(P<0.05);與DM-IR組比較,DM-DP組IL-17a水平降低、IL-10水平升高(P<0.05);與NDM-DP組比較,DM-DP組IL-17a水平升高、IL-10水平降低(P<0.05)。見圖1。

注:與NDM-C組相比, *P<0.05; 與NDM-DP組相比, &P<0.05; 與NDM-IR組相比, §P<0.05; 與DM-C組相比, △P<0.05; 與DM-IR組相比, #P<0.05。圖1 各組大鼠血清IL-17a、IL-10水平比較

2.3 各組大鼠心肌組織TUNEL染色和凋亡率比較與NDM-C組比較,NDM-IR組凋亡率升高(P<0.05);與NDM-IR組比較,NDM-DP組凋亡率降低(P<0.05);與DM-C組比較,DM-IR和DM-DP組凋亡率升高(P<0.05);與DM-IR組比較,DM-DP組凋亡率降低(P<0.05);與NDM-DP組比較,DM-DP組凋亡率升高(P<0.05),見表2。TUNEL染色結果見圖2。

表2 各組大鼠心肌組織凋亡率比較

2.4 各組大鼠心肌組織NF-κBp65蛋白表達及磷酸化水平的比較與NDM-C組比較,NDM-IR組NF-κB p65表達增高(P<0.05);與NDM-IR組比較,NDM-DP組NF-κB p65表達降低(P<0.05);與DM-C組比較,DM-IR組和DM-DP組p-NF-κB p65升高(P<0.05);與DM-IR組比較,DM-DP組p-NF-κB p65降低(P<0.05);與NDM-DP組比較,DM-DP組NF-κB p65、p-NF-κB p65增高(P<0.05);NDM各組間p-NF-κB p65水平和DM各組間NF-κB p65表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

注:與NDM-C組相比, *P<0.05; 與NDM-DP組相比, &P<0.05; 與NDM-IR組相比, §P<0.05; 與DM-C組相比, △P<0.05; 與DM-IR組相比, #P<0.05。圖3 各組大鼠心肌組織NF-κBp65、p-NF-κBp65蛋白的表達比較

3 討論

本實驗通過選用2型糖尿病大鼠和非2型糖尿病大鼠分別建立RIR模型,研究2型糖尿病因素削弱右美托咪定預處理對大鼠RIR后心肌損傷的保護效果的炎癥機制。研究發現,右美托咪定一定程度上能夠降低2型糖尿病大鼠RIR后心肌組織凋亡率,降低心肌損傷標志物cTnI的活性,通過干預NF-κB調節炎癥因子IL-17a與IL-10的含量,降低心肌凋亡率,但與右美托咪定干預非2型糖尿病大鼠RIR后心肌組織損傷情況對比,發現2型糖尿病是削弱右美托咪定預處理RIR后心肌損傷保護的關鍵因素。

cTnI的檢測已被證實對早期發現心肌損傷的特異性和敏感性方面具有獨特的優越性,是判斷心肌損傷的基石[6-7]。IL-17a、IL-10是參與體內炎性反應的重要炎性因子。本研究結果顯示,在非2型糖尿病大鼠中,RIR發生后IL-17a水平升高,抗炎因子IL-10水平降低,血清cTnI水平升高,心肌凋亡率明顯升高,表明RIR后會發生心肌損傷,對其實施右美托咪定預處理后,血清IL-17a水平降低,IL-10水平升高,cTnI水平降低,心肌凋亡率顯著降低,均提示右美托咪定預處理能夠有效緩解RIR帶來的心肌損傷,這與本課題組前期研究一致[8]。在2型糖尿病大鼠中,RIR發生后,心肌損傷的結局與非2型糖尿病大鼠RIR后類似,表明右美托咪定預處理依然能夠發揮心肌保護作用,然而對2型糖尿病大鼠腎缺血再灌注即便實施右美托咪定預處理后,IL-10水平和凋亡率仍未恢復至2型糖尿病對照組水平。提示2型糖尿病因素阻礙了右美托咪定預處理對腎缺血再灌注后的心肌保護效應。

炎癥介質在多種器官損傷[9-11]的病理生理機制中占重要地位。炎癥介質能夠在器官和血清中積累,觸發心肌凋亡[12]。本研究中,非2型糖尿病大鼠腎缺血再灌注組NF-κB p65表達較非2型糖尿病大鼠對照組明顯增加,而非2型糖尿病大鼠各組間p-NF-κB p65水平均無統計學差異,在2型糖尿病大鼠各組間NF-κB p65水平差異無統計學意義,反映了2型糖尿病因素使得機體始終處于炎癥狀態,NF-κB p65的表達閾值上調。同時,即便對2型糖尿病RIR大鼠實施DP,無論是NF-κB p65還是p-NF-κB p65均較非2型糖尿病RIR大鼠實施DP升高,提示2型糖尿病因素削弱了DP的保護作用。Itoh等[13]學者發現,IL-17a激活NF-κB,使其磷酸化,并刺激促炎因子如IL-6、TNF-α和GM-CSF誘導炎癥,進而參與糖尿病心肌的損傷。研究發現NF-κB激活后,誘導產生大量促炎細胞因子,造成器官損害[14]。說明NF-κB和炎癥因子的串擾加劇了靶器官損害。

本研究選用高糖高脂飲食聯合STZ注射的方法構建2型糖尿病模型。2型糖尿病往往伴隨嚴重的胰島素抵抗,疾病發生后降低了胰島素的心肌保護作用[15],造成“心肌敏化”,當遭受遠隔器官缺血再灌注后,損傷往往更為嚴重,其機制可能涉及糖代謝關鍵通路[16],激活NF-κB,誘發機體的慢性炎癥狀態,這可能也是阻礙右美托咪定預處理發揮抗炎作用的原因所在。

綜上,炎癥機制參與了糖尿病因素削弱右美托咪定預處理對RIR后心肌的保護作用。下一步,本研究將繼續探尋炎癥的關鍵信號通路,更完善地發揮右美托咪定預處理的效能,為臨床轉化提供科學依據。