實時直接分析質譜法在中藥質量研究中的應用進展

胡雙飛，張 奧，王永剛，蘇薇薇

實時直接分析質譜法在中藥質量研究中的應用進展

胡雙飛，張 奧，王永剛，蘇薇薇*

中山大學生命科學學院，廣東省中藥上市后質量與藥效再評價工程技術研究中心/廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點實驗室，廣東 廣州 510275

中藥化學成分組成是其物質基礎，針對中藥中有效成分、特征成分及有害物質的定性、定量分析，是闡明中藥藥效成分和鑒定其品質的主要方式。實時直接分析質譜（direct analysis in real time-mass spectrometry，DART-MS）技術無需或僅需簡單的樣品處理，具有快速、直接、現場檢測等特點，將其引入到中藥質量研究，有助于評價中藥質量的穩定性和安全性。通過對DART-MS離子源結構、原理及在中藥質量研究中的應用進行綜述，為該技術在中藥領域的應用提供參考。

實時直接分析質譜；有效成分；成分分析；中藥質量；快速分析

中藥質量是保證其藥效的根本，對藥材種類和品質的鑒定是確保中藥質量的關鍵環節[1]。發展快速、有效的質量檢測/鑒定手段，建立高效、精準的質量評價體系，對于保證中藥的質量安全至關重要，也是中藥產業發展的重要保障。

中藥化學成分復雜，鑒定其化學成分物質基礎與質量控制困難復雜。目前主要依靠質譜技術對中藥中的成分進行研究[2]。但傳統的色譜-質譜聯用技術，如高效液相色譜-質譜[3]和氣相色譜-質譜[4]等，存在基質效應、電離效率、繁瑣的樣品預處理等問題，且難以實時管控中藥的質量，限制了其廣泛應用。

實時直接分析質譜（direct analysis in real time-mass spectrometry，DART-MS）是一種非表面接觸分析/離子化質譜分析離子源技術，不僅能最大限度減少樣品量與樣品制備、降低檢測限和分析時間，而且具有較高的靈敏度、多成分同時測定、同時分析不同極性（極性、中等極性和非極性）成分等特點[5]。DART離子源快速實時分析化學成分的特點與中藥多成分同時分析的研究需求相匹配，能夠快速分析中藥成分的變化。然而，當前的DART-MS技術缺少與之匹配的數據庫，分析未知化合物解譜耗時較長。因此建立針對該技術的化合物數據庫，是適用于真偽鑒別、農藥殘留等檢測的有利方法，并能為研究中藥質量提供新的理論和方法。本文擬對DART-MS離子源結構、原理及在中藥質量研究中的應用進展進行綜述，為促進其在中藥中的應用提供參考。

1 DART離子源結構及原理

DART離子源是一種大氣壓氣體吸附電離源，外接He、Ar或N2等氣體進入DART內部時，通過高壓放電針產生輝光放電形成分析物離子體（離子、電子、亞穩態分子、原子等），然后氣體通過電極進入陶瓷加熱管獲得高能與動能，再經過柵網電極除去亞穩態物質與異電荷，最后產生的樣品離子進入質譜[6-7]，見圖1。

應用DART離子源時，解析氣體溫度、柵網電極電壓、進樣速度、解析氣體類型等對離子源檢測靈敏度具有重要作用，其中解析氣體溫度對DART的離子化性能影響最大[8]。在DART離子源中，解析氣溫度是影響其分析的首要因素[10]，其溫度高低可影響解析氣原子動能，導致DART的離子轉化率受到影響[8]，正負離子模式的選擇確定其是否檢出。

2 DART在中藥質量檢測中的應用

中藥質量受藥材來源、產地和采摘時間等多重因素的影響[9]，當前已有大量研究使用DART-MS技術實現對藥材的鑒別。通過對文獻調研發現，DART- MS在中藥質量研究中符合本研究的論文共納入94篇，其中中文22篇、英文72篇。按照中藥成分可分為生物堿類、黃酮類、苷類、揮發油類、有機酸類、糖類等，主要集中于生物堿類、黃酮苷元及有機酸等的研究，將發文量較少的酚類、有毒物質等的研究合并到其他類別中，見圖2。表明利用DART-MS技術用于中藥中其他化學成分研究相對較少，建議后續擴大該技術在中藥質量研究中的應用。

圖1 DART離子源原理

2.1 生物堿類

Singh等[10]在樣品未預處理情況下，使用DART-MS研究牧豆樹根、莖、花、葉和豆莢中的生物堿分布，并指認出不同類別生物堿，如哌啶生物堿和普羅索平生物堿，通過分布部位的含量比較，這些生物堿類成分在牧豆樹不同部位的分布存在差異，其中葉和豆莢中生物堿含量最高，且均含有12種不同的生物堿，而花中僅有4種生物堿。Singh等[11]應用DART-MS技術直接測定葉柄小檗中果實、葉、根和莖的化學成分，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）處理DART-TOF-MS獲得的數據，可實現對其部位進行有效區分。王洋等[12]采用DART-Orbitrap-MS確證了延胡索中延胡索甲素和延胡索乙素，并考察其定量方法的精密度與穩定性，實驗表明DART與質譜聯用能夠快速對延胡索素定量研究，且定性分析時無需樣品前處理。孫磊等[13]在未經前處理和色譜分離的情況下應用DART-MS檢測吐根生物堿，通過建立吐根莖和葉的特征圖譜，并采用外標法對吐根生物堿定量分析，結果發現吐根莖和葉的圖譜中均有明顯的吐根堿和吐根酚堿的質子離子峰。Zhu等[14]應用DART-MS技術鑒別附子炮制是否合格并篩選出其質量標志物，采用DART-MS技術獲取樣品中化合物數據信息，將16個附子樣品中發現的化合物（＝133）豐度歸一化處理并設為變量，利用指紋數據陣列進行奇異值分解實現PCA分析，該數據陣列由16×133個數據矩陣組成。結果顯示，該方法不僅能區分不同炮制程度的附子，而且便于篩選附子的質量標志物，主要為單酯型、雙酯型烏頭堿類，總之DART-MS技術結合多元數據分析為中藥的質量評價提供了一種靈活可靠的方法，主要流程見圖3。目前，將DART-MS技術與多元統計分析方法相結合，已成功應用于區分多種不同來源的中藥，如曼陀羅[15]、蘿芙木[16]、檳榔、川貝[17]等，并確定其中的質量標志物。

圖2 不同類別中藥成分在總發文章中的占比

圖3 DART-MS與多元統計分析方法鑒別中藥流程

通過DART-MS技術對中藥中生物堿類成分進行研究，可用于中藥質量穩定性、鑒別與溯源的評價。表明DART技術在中藥質量分析中具有重要作用，其中生物堿類成分檢測的最佳溫度大多集中在300 ℃，這可能與生物堿類成分性質較穩定相關，溫度過低離子源中解析不充分，響應度低，過高則可能導致成分分解和轉化[18]；DART離子源具有獨立的軟件控制系統，離子源分為正、負2種離子模式，檢測離子模式均為正離子模式時，可能是生物堿類成分含堿性氮原子，攜帶一個單位的正電荷或易攜帶正電荷，易產生質量數為自身相對分子質量的離子峰[M]+或[M＋H]+，由于其易結合質子，在正離子模式下響應較好，因此通常設置為正離子模式，DART-MS技術在生物堿類中藥中的應用見表1。

表1 DART-MS技術在含生物堿類成分中藥中的應用

2.2 黃酮苷元類

黃酮類成分生物活性多樣，是多種中藥的有效成分，如桑屬植物中存在大量的黃酮類成分，且具有抗菌、抗炎、降血壓等多種藥理作用[19]。近年來，DART技術已被用于含黃酮類成分中藥的檢測。李樂樂等[20]采用DART-Orbitrap MS技術設定解析氣溫度300 ℃，從黃芩中檢出黃芩素、漢黃芩素、韌黃芩素II等成分，并通過黃芩素和漢黃芩素離子流圖積分計算峰面積確定其含量。Chernetsova等[21]采用DART-Orbitrap MS對蜂膠中黃酮類成分和其他酚類成分進行分析，研究發現，在250 ℃這2類成分在負離子模式下基質效應少，而在正離子模式下可鑒定出多種化學成分，此外，應用DART-MS分析一個蜂膠樣品約30 s，具有快速分析的特點。Wang等[17]應用DART-MS技術定性分析黃芩中黃酮類成分，通過黃芩中主要活性成分黃芩素與漢黃芩素的峰優化氣體溫度，并根據碎裂過程對其電離機制進行討論，發現黃酮類成分在正離子模式下（200 ℃）響應較好。Huang等[22]利用演化氣體分析（evolved gas agalysis，EGA）-質譜聯用儀與DART-MS聯用對蜂膠進行分析，結果顯示在300～550 ℃，部分黃酮苷類、酚甘油酯和蜂蠟響應度較好。以上表明，DART-MS技術在中藥黃酮類成分定性定量時，最佳溫度在200～300 ℃。因黃酮類成分研究結果較少，未能充分反映最佳檢測黃酮類成分的范圍，故在確定溫度時，需根據化合物的性質確定溫度，防止因溫度低導致的解析不充分，同時防止因溫度過高導致樣品分解與碳化的問題[20]。黃酮類成分母核均含有3個環，其中C環為雜氧環，同時含有一個醚鍵和一個羥基鍵，易發生斷裂，故在正/負離子模式下均有較高的響應，其中多甲氧基黃酮在黃酮母核的基礎上被不同數量的羥基或甲氧基取代，在電離過程中，傾向于丟失甲基、水等中性小分子，如[M＋H－H2O]+，故在正離子模式下有較好的響應強度。

2.3 苷類

苷類成分具有止咳祛痰、抗炎平喘等功效[23]。Liu等[24]通過對人參中人參皂苷甲基衍生化處理，采用DART-MS分析人參皂苷Rb1、Rd、Re、Rf和Rg1的甲基化產物，樣品在甲基化后無需進一步純化即可檢測，進一步利用固相甲基化方法制備氘代甲基化人參皂苷，并將其作為內標進行定量分析，以上表明DART-MS技術通過聯合甲基化和氘代內標技術能夠對人參皂苷快速定量分析。Huang等[22]利用EGA-質譜聯用儀與DART-MS聯用分析蜂膠，結果顯示300～550 ℃部分黃酮苷類成分的響應度較好，在蜂膠樣品中，黃酮苷元及其糖苷占總黃酮的52.6%～66.7%，結果也表明EGA-質譜聯用儀與DART-MS聯用能夠有效分析蜂膠中的主要成分。應用DART-MS技術鑒定化合物時，除了合適的溫度，還需要選擇適合的正/負離子模式。金欣等[25]使用高效液相色譜-電噴霧質譜探討加和離子的形成機制，發現苷類成分在正離子模式下響應更強，因苷類成分以質子化分子離子[M＋H]+或陽離子加合物[M＋NH4]+、[M＋Na]+和[M＋K]+的形式被檢測，而在負離子模式下僅檢測到[M－H]?的形式，表明苷類成分的檢測模式選擇與苷元的分子結構相關。

2.4 揮發油類

中藥揮發油具有抗炎、抗過敏、驅蟲等作用[26]。DART-MS技術在含有揮發油類中藥質量檢測中的應用見表2，Maleknia等[27]應用DART-MS對桉樹中揮發性成分進行研究，在較低溫度（50～100 ℃）下，丙酮、乙醇、甲醇和低沸點萜烯類響應度較高，而在較高溫度（100～200 ℃）下，檢測沸點較高的萜烯和含量較少的化合物。陳志永等[28]以東莨菪素等為鑒別指標性成分，采用DART結合離子阱質譜建立了一種大果飛蛾藤藥材的快速鑒別方法。Huang等[22]利用EGA-質譜聯用儀與DART-MS聯用對蜂膠進行分析，發現在120～160 ℃，萜類成分響應較高；且通過萜類成分的含量能夠對不同產區的蜂膠進行有效區分。Bajpai等[29]利用DART-MS分析數據與PCA分析相結合的方式可有效區分不同品種的蔞葉。該方法同樣用于芫荽、羅勒和綠薄荷中揮發性成分的鑒定[30]，區分蓽澄茄果、當歸、川芎[31-32]等的不同品種與產地等。綜上，DART-MS可應用于中藥揮發性成分的定性分析。揮發性成分根據沸點的不同，在較低溫度下低沸點的揮發性成分100 ℃響應度較高，高沸點的揮發油類響應度較高時，對應的最佳溫度為300 ℃。

表2 DART-MS技術在揮發油類中藥材中的應用

2.5 有機酸類

有機酸是中藥的藥效成分之一，如綠原酸等，具有抗菌、消炎、治療心腦血管等作用[33]。DART-MS技術已應用于中藥有機酸的研究。孫磊等[34]應用DART-MS技術在未經前處理和色譜分離的情況下快速鑒別乳香中乳香酸類成分，發現DART-MS法能夠迅速準確鑒別乳香中的特征成分，且無需對照，但對比色譜分離的樣品，未經處理的樣品難以區分相同化學式的同分異構體。陳志永等[28]發現DART-MS可用于大果飛蛾藤藥材的定性鑒別。該方法同樣已實現鑒定厚葉巖白菜的有機酸類[35]、丁公藤中的綠原酸[29]及蜂膠中的酚酸[22]等。Huang等[22]利用EGA-質譜聯用儀與DART-MS聯用對蜂膠進行分析，結果顯示在160～300 ℃，酚酸類成分的響應度較好。檢測有機酸時，若化合物的揮發性較差，則其在較高溫度下才能解析，需選擇相對較高的溫度[34]。在正/負離子模式選擇上，因有機酸類含有一個-COOH基團，易脫H，故在負離子模式時離子響應度更高。斷裂過程中，通常先脫去H2O、CO、COOH、HCOOH、CH3、CH3O等，并產生相應的碎片離子。若有機酸中除含有羧基外，亦包含其他基團，如氨基等，需要根據基團的影響強弱和不同離子模式背景下的復雜度和噪聲高低來決定。李無雙等[36]采用DART-MS技術對桑葉中γ-氨基丁酸進行定性定量分析，研究表明最佳響應溫度為500 ℃，檢測模式為正離子模式化學成分響應較好，且基質效應少[37]，由于該技術進樣前無樣品前處理過程，極大地縮短了分析時間。另外，γ-氨基丁酸采用DART-MS檢測時氨基比羧基可更快的離子化。綜上，DART-MS技術用于大批量桑葉樣品中γ-氨基丁酸含量測定，可以實現實驗室高通量分析。

2.6 多糖類

多糖類是中藥中一個重要的化學基團，具有抗癌、細胞識別、抗病毒等特性[38]。糖類成分自身極性大、親水作用力強、黏性大，且糖類成分分子中多含有羥基，在裂解過程中單糖容易丟失CO、H2O、C3H6O3、C4H8O4等，而低聚糖中的單糖結構易整體丟失，同時伴隨CO、C3H6O3等小分子的脫落，故低聚糖和多糖在負離子模式下響應更好。但單糖和雙糖因其易與氨形成加合物[M＋NH4]+，在正離子模式也能獲得較好的響應度。Liu等[24]采用DART-MS技術研究不同類型的糖類，如單糖、雙糖和三糖在不同溫度下以正離子模式進行檢測。通過氣體溫度的升高，易觀察到單糖、雙糖標準的糖簇和氨加合物[M＋NH4]+。然而，三糖和人參低聚糖提取物在DART-MS檢測時，難以在未衍生化的情況下形成氨加合物[M＋NH4]+，故在檢測三糖等成分時，應先進行衍生化處理。蔣青等[39]采用DART-MS和機械力化學提取法相結合測定黃芪、銀耳、百合、茯苓、鼓槌石斛、金釵石斛、鐵皮石斛和黨參8種中藥多糖，結果表明機械力化學提取法與DART-MS相結合可簡單、快速、高通量的從復雜多糖大分子中獲取特征指紋圖譜，為其他天然藥物多糖類成分的鑒別提供了新思路。

2.7 其他

Chernetsova等[35]采用簡化的DART離子源結合高分辨率質譜以負離子模式鑒定了青海巖白菜生葉中的酚類成分；DART技術同樣應用于白芷[40]、肉桂[41]、朝鮮當歸[32,42]等中藥中香豆素類成分的鑒別與定量等分析，及五味子中木脂素[43]、五味子素[44]等的測定，以上表明，DART技術是一種研究中藥快速鑒別及定量方法，能夠為中藥安全評價提供理論依據。

中藥的質量安全取決于所含的藥效成分和有害的雜質部分[45]，在質量控制領域，DART-MS技術已應用于中藥中有害物質與農藥殘留等快速檢測與分析。Vaclavik等[46]和Busman等[47]采用DART和高分辨質譜聯用檢測了小麥、玉米中的多種真菌毒素，并對其進行快速定量分析，結果表明，DART-MS可用于檢測中藥中的毒素。此外，該方法已用于檢測玉米中的黃曲霉毒素B1[48]、蜂蜜中的5-羥甲基糠醛[49]與氯霉素等[50]。Wang等[51]采用DART與氣相色譜-質譜聯用的方式檢測出稻殼中的次氯酸鈉氧化產物。Shen等[18]采用DART-MS鑒定出八角茴香中的莽草毒素。Schurek等[52]指認了小麥中的殺菌劑嘧菌酯和吡唑醚菌酯等。Danhelova等[53]采用DART-TOF-MS方法對不同咖啡樣品中的咖啡因進行了定量研究。黃鑫等[45]采用DART對中藥中的農藥殘留進行分析，針對100多種農藥殘留成分展開了快速檢測，發現多種農藥殘留在DART電離過程中形成加合離子，并能夠產生碎片離子。綜上，通過DART與其他檢測技術聯合，在中藥質量安全控制中具有重要作用，并已具備實現定量分析基礎，為中藥的質量安全保障提供了一種新的方法，表明該技術在中藥質量研究領域具有廣闊的發展空間與應用前景。

3 結語與展望

隨著中藥的市場需求增大，亟需建立高效、精準的質量評價體系，DART-MS因其樣品前處理簡單、分析時間短等優勢已成為一種科學分析中藥化學成分的新方法，在多種中藥的化學成分分析中已積累了應用經驗。采用DART-MS研究中藥時，解析氣體的溫度與正負離子模式是影響其實驗結果的主要因素。其中，解析氣體溫度設定取決于化合物的理化性質，若化合物屬于熱穩定類，氣體溫度高有利于化學成分解析并獲得更高的離子響應度；若化合物為熱不穩定類，解析氣體溫度過高可能導致信號降低甚至消失等。若化合物易結合質子，則正離子模式下相應較好，若傾向脫H，則在負離子模式下響應較好。綜上，DART-MS技術主要具備以下4點優勢。

（1）無需制樣具備直接檢測中藥材物質基礎優勢，如孫磊等[34]使用DART-MS技術檢測乳香中的乳香酸類成分，無需前期制樣能夠獲得乳香的特征圖譜，具有明顯的指紋特征，且與文獻報道的電噴霧離子源結果一致。Yao等[54]通過DART-MS技術定量分析金銀花提取物中的綠原酸，所得結果與高效液相色譜結果一致。（2）具備同時分析水溶性與脂溶性成分的特點。Huang等[22]使用DART-MS結合分析熱技術分析中國粗蜂膠的成分，同時分析出多種水溶性和脂溶性成分，獲得了萜類成分、碳氫化合物、類黃酮類和酚酸類等成分的特征圖譜，為全面快速揭示中藥成分提供了新的方向。（3）程序升溫分析中藥物質組成基礎，獲取更豐富的化合物信息。Maleknia等[27]使用DART-MS通過調整溫度梯度為100、200、300 ℃研究揮發性有機化合物。在100 ℃的條件下獲得的成分是一系列反應性烴；在200 ℃的條件下主要獲取相對較高沸點的植物特異性萜類；當溫度大于300 ℃時主要是植物纖維進行熱解析后產生的成分。該研究表明DART-MS具有在不同溫度鑒別分析出不同類別的化合物的特點，從而實現快速分析中藥化學成分的目的。（4）與多元統計方法聯合實現中藥質量快速鑒別。通過DART-MS技術在幾秒內獲取化合物信息，打破了傳統藥物分析周期長的局限，將化合物數據導入多元統計方法模型中，能夠快速實現中藥質量的鑒別，故開發內置多元統計方法的工具能夠實現快速鑒別中藥目標，將成為現場鑒別中藥質量的重要工具之一。農藥殘留是影響中藥安全問題之一，DART-MS技術已應用于中藥中有害物質與農藥殘留等檢測中，以保證中藥的安全，將DART-MS技術與多元統計方法聯合設置中藥的有害物質與農藥殘留的含量等級標準，并為開發便攜式鑒別中藥質量的設備提供了思路。

DART-MS技術用于研究中藥的質量具有諸多優勢，目前仍存在一些局限性[8]，如DART在檢測時檢測環境對其干擾較大，中藥有效成分容易疏漏，難以實現同一個條件下檢出所有有效成分；對化學成分進行定量分析的手段需要優化等；此外，DART-MS缺少匹配數據庫，后續分析未知化合物耗時較多。針對以上問題，建議開發更精確的進樣裝置，或特異性結合的解析電離方法，建立其對應的數據庫，進一步拓展其在中藥材領域的應用。

隨著DART離子源技術革新，并與新技術聯合使用的開發，DART離子源在中藥質量控制與鑒別領域將會有廣闊的應用前景。通過DART離子源對目標中藥進行全成分分析與特征圖譜的建立，與便攜式質譜儀結合有望對中藥現場鑒定與質量提供保證。中藥的質量與藥效密切相關，不同產地的中藥藥效存在差異，從中藥的特征性成分確定中藥質量，快速鑒別中藥的質量，已成為研究熱點。中藥由于其復雜性，使得樣品預處理在常規分析中發揮著不可或缺的作用。DART-MS為中藥研究提供了一個新契機，只需很少甚至無需樣品預處理和液相色譜分離，極大縮短了總分析時間和消耗量。隨著DART技術的發展，DART的更廣泛和深入的應用，如高通量分析、快速定量、中藥代謝物成像和快速非法添加劑篩選，將在未來的高效中藥研究中得到有趣的嘗試。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Application progress on direct analysis in real time-mass spectrometry in quality study of traditional Chinese medicine

HU Shuang-fei, ZHANG Ao, WANG Yong-gang, SU Wei-wei

School of Life Science, Guangdong Engineering and Technology Research Center for Quality and Efficacy Re-Evaluation of Post-Marketed TCM/Guangdong Key Laboratory of Plant Resources, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510275, China

The properties of traditional Chinese medicine are determined by its chemical composition. Qualitative and quantitative analysis based on effective, characteristic and harmful components has been commonly used for accessing medicinal ingredients and evaluating the quality of traditional Chinese medicine. Direct analysis in real time-mass spectrometry (DART-MS) technique allows rapid, direct and on-site detection with minimal-to-no sample preparation. Thus, the introduction of which is conductive to evaluation of the stability and security for the quality of traditional Chinese medicine. The technique needs no or only simple sample treatment, and has the characteristics of fast, direct and on-site detection. The application of DART-MS technology in the quality research of traditional Chinese medicine was reviewed to provide reference for the application of this technology in the field of traditional Chinese medicine.

direct analysis in real time-mass spectrometry; active ingredient; component analysis; quality of traditional Chinese medicine; rapid analysis

R284

A

0253 - 2670(2023)13 - 4377 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.031

2022-12-07

“十四五”廣東省農業科技創新十大主攻方向“揭榜掛帥”項目（2022SDZG07）

胡雙飛（1992—），女，博士研究生，研究方向為天然產物研究。E-mail: hushf8@mail2.sysu.edu.cn

通信作者：蘇薇薇，博士生導師，教授，從事創新藥物研制、中藥上市后再評價及中藥國際化研究。E-mail: lsssww@126.com

[責任編輯 趙慧亮]