基于UPLC-MS技術分析鐵皮石斛炮制前后糖類成分差異

陳志琳，趙 穎，李 瑋，楊立新*

基于UPLC-MS技術分析鐵皮石斛炮制前后糖類成分差異

陳志琳1, 2，趙 穎2, 3，李 瑋1*，楊立新2, 3*

1. 貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025 2. 中國科學院昆明植物研究所植物醫生研發中心，云南 昆明 650201 3. 云南省生物多樣性和傳統知識研究會，云南 昆明 650034

研究鐵皮石斛鮮條及其炮制品中糖類化合物，探討鐵皮石斛炮制前后對糖類化合物積累的影響，為鐵皮石斛炮制工藝提供基礎研究。采用超高效液相色譜-串聯高分辨質譜（UPLC-MS）非靶向技術對鐵皮石斛鮮條及其炮制品代謝物質進行檢測，使用主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析法（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）鑒定代謝物中糖類化合物的差異代謝物。共鑒定76個糖類化合物，61個糖類化合物在西楓斗中上調積累。其中麥芽五糖和麥芽六糖炮制前后差異倍數達30倍，15個糖類化合物及其團聚體下調積累，炮制前后下調的差異倍數幅度較小。炮制明顯提升鐵皮石斛炮制品西楓斗中代謝物的積累，研究結果為西楓斗炮制的深入研究提供理論基礎。

鐵皮石斛；西楓斗；炮制方法；UPLC-MS；糖類化合物

云南是石斛原產地之一，廣南鐵皮石斛“西楓斗”馳名中外，“楓斗”據《本草綱目拾遺》記載至今已有200多年歷史。由于新鮮的石斛不能長久保存，通過炮制將新鮮石斛炮制成楓斗后不易霉爛、蟲蛀和變質，同時由于石斛類植物的莖多含有黏液成分，炮制成楓斗后其黏液成分被固化而穩定，使有效成分不易分解[12]。本研究采用的西楓斗為廣南縣壯族手工制作，主要分為以下6個步驟：（1）經分類成3個等級；（2）炒草：用猛火炒、反復搓揉去皮后晾置2～3 d，讓其回軟有韌性；（3）分段：剪為3～5 cm的長段；（4）繞圈，溫火烤軟，扭制繞圈第一步定形，冷卻，再溫火烘烤、再搓揉去皮、鞏固繞圈，反復3次可完全定形；（5）修剪：剪棄毛邊、棱角；（6）烤干：溫火慢烤至干透方成。整個過程一般需要一周時間，火溫的控制是制作優質西楓斗的關鍵，如火溫、烤制時間掌握不當，便會出現“死草”，不能繞圈定形。

糖類化合物是最豐富的天然產物。除了在新陳代謝和構造方面的作用，它們是每個細胞表面的基本成分，參與了重要的細胞識別過程[13]。鐵皮石斛中富含豐富的糖類物質，這些糖類物質與苷元結合發揮更多的生物活性[14]。鐵皮石斛多糖（polysaccharide，DOP）為其主要的活性成分，也是其中含量最高的物質，主要包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖及微量果糖，多糖是鐵皮石斛抗氧化、清除自由基等藥理作用的主要成分，經研究發現，石斛多糖含量越高，質量越重，咀嚼越粘稠，則藥性價值也就越好，種質更加優質[15-17]。品種、生長期、部位、產地、炮制等均會影響多糖含量[18]。鐵皮石斛在民族民間傳統炮制西楓斗的手工工藝，亦是影響其質量的重要因素[19]。然而，對鐵皮石斛炮制前后代謝物的變化規律及其相關藥理活性之間的關系鮮有研究。

目前對鐵皮石斛藥材的研究主要集中于化學成分、藥理作用和資源研究方面，對于不同炮制方法的研究主要集中于主要成分含量變化，亦有指紋圖譜研究，紫外譜線組鑒別等，而西楓斗的研究鮮有報道。本實驗采用高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS）結合植物非靶向代謝組學技術整體表征鐵皮石斛鮮條及其炮制品西楓斗中糖類化合物差異性。為發掘鐵皮石斛炮制前后代謝物的變化與相關藥理活性之間的潛在規律，闡明鐵皮石斛炮制過程中的主要糖類化合物物質變化，為鐵皮石斛炮制方法提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

樣品采自我國西南部云南省文山州廣南縣，西楓斗為同一批次鐵皮石斛藥材炮制品。樣品由中國科學院昆明植物研究所楊立新教授鑒定為鐵皮石斛Kimura et Migo鮮條。模式標本保存于昆明植物標本館。

1.2 儀器

Dionex U3000型高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技公司），QE型高分辨質譜儀（賽默飛世爾科技公司），ACQUITY UPLC HSS T3型色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters公司）。主要試劑包括甲醇、甲酸、水、乙腈均購自Thermo公司，-2-氯苯丙氨酸購自上海恒創生物科技有限公司。所有化學藥品和溶劑均為分析純或色譜級。

2 方法

2.1 樣品制備

選擇同樣大小的樣本，液氮下研碎，均勻混合，鮮品和炮制品均4次生物學重復，共8個樣品。此外，鐵皮石斛鮮條及其炮制品樣品等量混合成質控樣本，共3個重復，用于檢測儀器的重復性和精確度。用于分析的鐵皮石斛鮮條和西楓斗分別為80 mg，轉入1.5 mL微離心管，加入2個小鋼球。然后，將20 μL的l-2-氯苯丙氨酸（0.3 mg/mL甲醇）加入1.0 mL的甲醇-水7∶3中作為內標。冷凍2 min至-20 ℃，60 Hz研磨2 min，冰水浴超聲提取30 min，-20 ℃培養20 min，4 ℃，13 000 r/min離心10 min。用玻璃注射器收集上清液150 μL，用微過濾器（0.22 μm）濾過上清液，備用。

2.2 液相色譜-質譜分析條件

2.2.1 色譜條件：ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm ×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱；柱溫為40 ℃；流動相為A-水（含0.1%甲酸），B-乙腈（含0.1%甲酸）；體積流量0.35 mL/min；進樣體積為5 μL；梯度為0～1 min，95% A；1.0～2.5 min，95%～70% A；2.5～6.0 min，70%～50% A；6～7 min，50%～30% A；7～10 min，30%～20% A；10～12 min，20%～0% A；12～14.2 min，100% B；14.2～16 min，95% A。

2.2.2 采用正負離子模式檢測 霧化氣體為高純度（N2），噴涂電壓3800 V，毛細管溫度320 ℃，輔助燃氣加熱器溫度350 ℃，質量范圍/100～1200。MS掃描的分辨率為70 000，高能碰撞解離（HCD）MS/MS掃描的分辨率為17 500，碰撞能量分別為10、20和40 eV。

2.3 數據處理

Progenesis QI V2.3（Nonlinear Dynamics，Newcastle，UK）軟件進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化，每個色譜峰的峰面積代表對應物質的相對含量，導出數據矩陣。利用三重四級桿質譜的多反應監測模式（MRM）將獲得的二級質譜數據與數據庫進行比對，對化合物進行定性、定量分析。使用數據庫包括邁維公司自建MWDB、MassBank、HMDB等數據庫。R軟件ropls包對數據矩陣進行PCA和OPLS-DA、PLS-DA分析，鑒定差異性代謝產物。使用R軟件pheatmap包進行聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA），以表征不同樣本代謝物的積累模式。

3 結果與分析

3.1 鐵皮石斛炮制前后糖類化合物的鑒定

根據設定的液相色譜質譜條件，取供試品溶液進樣分析。UPLC-MS首先以正、負離子模式對混樣質控QC樣品進行檢測，質控樣本TIC曲線重疊性高、質譜峰保留時間和強度一致，表明所建方法可靠、儀器穩定性較好（圖1）。所獲得的代謝物高分辨二級質譜數據經與公共數據庫比對，從鐵皮石斛鮮品和炮制品中共鑒定76個糖類化合物。從表1中差異倍數值可以看出，西楓斗樣品中有61個糖類化合物上調高積累，而有15個糖類化合物下調積累。其中，在上調的糖類化合物中，西楓斗中有52個糖類化合物的差異倍數至少是鐵皮石斛鮮條的2倍，尤其是麥芽五糖和麥芽六糖的差異倍數炮制前后達30倍。在下調的糖類化合物中，2-磷芒果苷和花青素。3-(6-咖啡基葡萄糖苷)-5-葡萄糖苷、芐基-[阿拉伯呋喃磺基- (1→6)-葡萄糖苷]、1---肉桂基-(6-阿拉伯糖基)、5a,6a-環氧-7e-megastigmene-3b,9e-二醇9-葡萄糖苷西楓斗的差異倍數比鐵皮石斛鮮條平均降低3倍，有15個糖類化合物的差異倍數是鐵皮石斛鮮條的2倍以下。以上結果顯示，鐵皮石斛炮制前后糖類化合物的積累有顯著性差異

圖1 鐵皮石斛糖類化合物正離子模式總離子圖

3.2 PCA和代謝物積累模式分析

代謝組數據經標準化處理后進行PCA分析，前2個主成分特征值＞1，模型累積解釋率R為0.83。一般認為R大于0.5，表示模型可靠，值越大越能反映樣本間的差異。PCA得分見（圖2-A），表明各組樣本分布于不同區域，所建立方法可良好表征炮制前后代謝物的差異性。變量載荷圖顯示幾種物質位于坐標邊緣（圖2-B），表明這些物質在組間樣本中差異明顯（有較大/較小的極端值等），它們對排序空間和樣本差異的貢獻較大，是潛在的重要標志性代謝物。其中，差異較大的代謝物包括了糖類化合物，例如，-紅血球--半乳糖-辛糖醇、麥芽五糖、麥芽六糖、()-2--肉桂酰-β--吡喃葡萄糖、(8,8)-海杉醇9-木糖苷、乙基香草醛糖苷、1-(3-甲基-2-丁烯基)-6-無糖基葡萄糖、3-呋喃甲醇葡萄糖苷、乙酯--吡喃葡萄糖苷、呋喃醇4-葡萄糖苷等。此外，聚類分析顯示（圖2-C），不同組間代謝物積累模式存在明顯的差異，同一組的樣本代謝物積累趨勢較為一致且高度聚合為一支。

表1 鐵皮石斛鮮條和西楓斗糖類差異代謝物

N/A表示未查到活性報道

N/A indicates no activity reports have been found

圖2 不同炮制方法樣品PCA分析及代謝物積累模式

3.3 炮制前后糖類化合物差異的鑒定

OPLS-DA為分類監督模式識別方法，可降低樣本組內差異，能更加準確表征樣本組間特征。為進一步挖掘鐵皮石斛鮮條及其炮制品中代謝物的差異性，鑒定潛在的差異性糖類物質，分別對鐵皮石斛炮制前后組間代謝數據進行OPLS-DA分析。根據OPLS-DA模型的變量重要性投影（variable importance in project，VIP）鑒定差異代謝物，標準為VIP＞1且單維檢驗＜0.05（差異倍數值＞2），共鑒定37個差異物質（表1）。由表1分析發現，西楓斗與鮮條共存在37個差異物質，且均在西楓斗組上調高積累。OPLS-DA模型優化表明鮮條與西楓斗的R、R值，分別為0.98、1.00，OPLS-DA得分圖如圖3所示，表明所建立的模型對組間樣品具有良好的區分度，相同組內樣品高度聚合一類。OPLS-DA排列驗證（＝200）實驗表明2組模型的原始R和Q均大于置換后的相應的值，暗示2組模型未過度擬合，可用于后續代謝物的鑒定。

研究結果表明在鐵皮石斛鮮條及其炮制品的糖類化合物代謝過程中，由表1可以看出鐵皮石斛炮個糖類化合物差異變化最大為-紅血球--半乳糖-制前后25個糖類化合物存在較大差異。其中，10辛糖醇、麥芽五糖、麥芽六糖、()-2--肉桂酰-β--吡喃葡萄糖、(8,8)-海杉醇9-木糖苷、乙基香草醛糖苷、1-(3-甲基-2-丁烯基)-6-無糖基葡萄糖、3-呋喃甲醇葡萄糖苷、乙酯--吡喃葡萄糖苷、呋喃醇4-葡萄糖苷，且25個糖類化合物在炮制品中上調積累。典型糖類化合物結構見圖4。

圖3 鮮品和炮制品的OPLS-DA得分圖

圖4 西楓斗中典型糖類化合物的化學結構

4 討論

本實驗將植物代謝組學的研究方法和思路應用于鐵皮石斛炮制前后糖類代謝物差異的研究，麥芽五糖和麥芽六糖是一種直鏈麥芽低聚糖，由α（1→4）鏈接-葡萄糖單體和痕跡量的（1→6）鏈接葡萄糖縮合組成，聚合度分別為5和6[33]。麥芽五糖和麥芽六糖作為鐵皮石斛的重要次級代謝產物，其含量的高低對于鐵皮石斛的藥理活性具有重要影響，麥芽五糖和麥芽六糖甜度低，在食品中常作為口感柔和的低甜味劑使用，同時，麥芽五糖和麥芽六糖具有較強的持水性，作為保濕劑被廣泛應用于化妝品[34]。此外，作為一種直鏈麥芽低聚糖，麥芽五糖和麥芽六糖可以不經胃的消化直接進入小腸，被小腸內的α-葡萄糖苷酶水解進而進入血液迅速合成糖原，加速肌糖原和肝糖原的恢復，其所引起的胰島素反應和血糖反應比葡萄糖平穩，能長時間的為人體提高能量。同時能防止運動時大量乳酸的形成，對于運動員和肝、腎病患者是一種理想的能量補充來源[35]。麥芽五糖和麥芽六糖在食品、醫藥、化妝品等領域被廣泛應用。

因此，解析傳統西楓斗的炮制工藝，從而提高鐵皮石斛中麥芽五糖和麥芽六糖的含量是非常有意義的。但是，其變化是否能夠支撐鐵皮石斛炮制品主要生物活性仍需要進一步進行相對應生物活性的體內外藥理活性研究。其次，本研究首次通過代謝組學技術從鐵皮石斛中檢測到具有顯著護膚活性的糖類化合物，如海藻糖是一種植物天然保濕劑，具有很好的鎖水性；α-松油基葡萄糖苷、3,5-二羥基苯基1--(6--沒食子酰基--吡喃葡萄糖苷)、羥基酪醇1--葡萄糖苷具有很好的抗氧化作用；(4, 5,7,11)-11,12-OH-1(10)-spirovetiven2-1,11-gly-(3,7,9)-9-OH-4,7-megastigmadien- 3-one 9-gly是天然的表面活性劑；羥基酪醇1--葡萄糖苷、甲基β--吡喃葡萄糖苷具有抗炎的作用。這些物質因具有與護膚相關的作用而被廣泛應用于化妝品中。

本研究從植物代謝組學的角度分析得出鐵皮石斛炮制成西楓斗，更有利于糖類化合物的積累，鐵皮石斛糖類物質具有多種藥理活性，包括在護膚化妝品領域的多種活性，經研究表明，鐵皮石斛多糖主要的生物活性化合物具有保濕、抗氧化、抗衰老和促進頭發生長的作用，受到皮膚科醫生和化妝品界的高度重視，應用在護膚領域具有抗炎修復、止癢、抗輻射及抗衰老4大功效[36-38]。本研究結果不僅揭示了云南省文山州廣南縣鐵皮石斛獨特的“西楓斗”傳統炮制工藝價值，而且解析了西楓斗中豐富的糖類物質，這些糖類物質是鐵皮石斛發揮藥理功效的重要物質基礎。本研究結果顯示：鐵皮石斛炮制成西楓斗更有利于糖類化合物的積累，與護膚相關的糖類化合物上調導致相關物質的高積累特點，與生品相比具有顯著性差異。分析原因可能與鐵皮石斛炮制成西楓斗過程中糖類成分被固化穩定，使有效成分不易分解有關。

對西楓斗的深入研究需借助現代分析檢測手段，開展鐵皮石斛炮制前后主要功效物質成分的變化規律及主要功效物質的含量變化，采用現代藥理學方法對鐵皮石斛炮制前后主要活性物質進行監測、鑒定、評價，例如用主要功效物質進行抗氧化、美白、抗炎、抗紫外線等皮膚化妝品活性研究，篩選鐵皮石斛炮制前后不同護膚功效活性物質，并進一步探索其活性物質的作用機制，研發其在不同功效護膚品中的應用，以期為西楓斗深加工工藝和鐵皮石斛提取物在化妝品領域的應用進一步提供科學依據，該研究為中藥現代化和中藥材的炮制工藝的評價方法與標準的制定提供一個案例支撐。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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UPLC-MS metabonomics technology revealing difference of carbohydrate inunder different processing methods

CHEN Zhi-lin1, 2, ZHAO Ying2, 3, LI wei1, YANG Li-xin2, 3

1. Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China 2. Bio - Innovation Center of DR PLANT, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650201, China 3. Center of Biodiversity and Indigenous Knowledge, Kunming 650034, China

To study the sugar compounds in rawand its processed products, to explore the effect ofon the accumulation of sugar compounds before and after processing, and to provide preliminary applied basic research for the processing technology of. Xifengdou.High liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS) non-targeted technology was used to detect the metabolites ofand its processed products. Principal component analysis (PCA) and orthogonal partial minimum Orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) was used to identify differential metabolites of carbohydrates in metabolites.A total of 76 carbohydrates were identified, and 61 carbohydrates were up-regulated and accumulated in Xifengdou. Among them, maltopentaose and maltohexaose had a 30-fold difference before and after processing, and 15 sugar compounds and their aggregates were down-regulated and accumulated, and the difference in the fold before and after processing was small.Processing significantly increases the accumulation of metabolites in Xifengdou, a processedproduct. The research results provide a theoretical basis for the in-depth study of Xifengdou concoction.

Dendrobium officinaleKimura et Migo; UPLC-MS; Xifengdou; carbohydrate compounds

R286.2

A

0253 - 2670(2023)13 - 4321 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.025

2022-12-06

國家自然科學基金面上項目（31970357）；植物醫生項目（Y8570842C1）；中國科學院東南亞生物多樣性研究中心（2015CASEABRIRG001）；Southeast Asia Biodiversity Research Institute, Chinese Academy of Sciences (Grant Nos. 2015CASE-ABRIRG001，Y4ZK111B01)

陳志琳，在讀碩士，主要從事中藥炮制與中藥材產地加工研究。E-mail: 1427882883@qq.com

通信作者：楊立新，高級工程師，主要從事民族植物學研究。E-mail: rattan@mail.kib.ac.cn

李 瑋，教授，主要從事中藥民族藥產地加工與炮制研究。E-mail: 3304676447@qq.com

[責任編輯 時圣明]