不同產(chǎn)區(qū)艾葉ISSR遺傳多樣性分析

余孟娟，趙博宇，董誠明，李 詢，邢 冰，李 曼

不同產(chǎn)區(qū)艾葉ISSR遺傳多樣性分析

余孟娟，趙博宇，董誠明*，李 詢，邢 冰，李 曼

河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 河南 450046

對不同產(chǎn)區(qū)艾葉進(jìn)行遺傳多樣性分析，為艾葉規(guī)范化種植及新品種選育工作奠定基礎(chǔ)。采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對36個不同產(chǎn)區(qū)的艾葉樣品進(jìn)行擴(kuò)增，然后利用POPGENEv1.32軟件進(jìn)行遺傳學(xué)分析，得出它們的遺傳特征系數(shù)，用Ntsyspc2.1對艾葉ISSR分子標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行UPGMA聚類分析。篩選出16條引物，共擴(kuò)增出條帶402條，其中多態(tài)性條帶398條，多態(tài)性百分比為99%；在對栽培種和野生種之間遺傳距離分析后發(fā)現(xiàn)，兩者之間的遺傳一致度為0.989 1，遺傳距離為0.011 0；對按緯度劃分的4個區(qū)域艾資源進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳變異分析，4個區(qū)域間基因多樣性指數(shù)（diversity index，t）為0.192 7、遺傳多樣性指數(shù)（genetic diversity index，s）為0.164 2、遺傳變異指數(shù)（genetic variation index，st）為0.147 9、基因流（gene flow，m）為2.881 8，NTSYSpc軟件對4個區(qū)域進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，可將4個區(qū)位劃分為2大類，且4區(qū)位相鄰2個之間均具有一定的遺傳相似性。艾葉具有極其豐富的遺傳多樣性，栽培種和野生種之間親緣關(guān)系接近、遺傳背景差異較小。艾葉其遺傳特性隨著緯度的變化呈現(xiàn)出一種遞進(jìn)式遺傳擴(kuò)散，其中河南南部居群多樣性最為豐富，其次為河南中西部和河南中部，北部居群遺傳多樣性最低。

艾葉；ISSR分子標(biāo)記；遺傳多樣性；栽培；野生；不同緯度

艾葉為菊科植物艾LevletVant的干燥葉，性溫，味苦、辛，有溫經(jīng)止血、散寒止痛之功效。在臨床上可分為外用和內(nèi)服2類，其中外用以火灸著名，而內(nèi)服用途甚廣。我國艾分布范圍較廣，從東北到華南均有生長[1]。國內(nèi)外對艾葉成分含量、藥理藥效及化學(xué)成分的提取均有比較深入的研究[2-3]，但利用分子生物學(xué)手段對不同產(chǎn)地艾葉種質(zhì)資源遺傳多樣性的探索卻較少[4-5]。遺傳多樣性的本質(zhì)是遺傳物質(zhì)變異，探索遺傳多樣性是研究植物進(jìn)化和親緣關(guān)系的基礎(chǔ)[6]，故將現(xiàn)代分子生物技術(shù)應(yīng)用于艾規(guī)范化種植及輔助育種進(jìn)而發(fā)掘優(yōu)良資源或改良資源顯得尤為重要[7]。王惠君等[5]在2015年首次將分子標(biāo)記方法應(yīng)用到艾葉的種質(zhì)資源多樣性研究領(lǐng)域，但其卻未能收集到北艾的種質(zhì)資源，分析其遺傳多樣性，在《國藥提要》《中國藥學(xué)大詞典》以及國外的《泰西本草名疏》中均以北艾作為艾葉的正品基原，本實(shí)驗(yàn)所用樣品包括北艾，填補(bǔ)了北艾種質(zhì)資源多樣性研究的空白。

簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增（inter-simple sequence repeat，ISSR）是基于微衛(wèi)星系列發(fā)展來的分子標(biāo)記技術(shù)，具有快速高效、引物特異性強(qiáng)、多態(tài)性好等優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用于品種鑒定、物種分類、居群遺傳學(xué)研究等領(lǐng)域，是研究植物遺傳多樣性常用的分子生物學(xué)方法[8-10]。因此本研究擬采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對我國傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)的36份艾葉從分子水平分析其遺傳多樣性，旨在從DNA水平上探明艾葉資源遺傳多樣性現(xiàn)狀；野生艾葉和栽培艾葉遺傳多樣性差距以及緯度與艾葉遺傳多樣性的關(guān)系，為今后艾的種質(zhì)資源利用和品種選育等奠定基礎(chǔ)[11-12]]，因而具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料和儀器

1.1 材料

查閱《中國植物志》《中藥志》《河南植物志》《河南志》等相關(guān)資料和文獻(xiàn)，了解艾葉生境、分布、栽培等信息，以北緯38°20′40″到北緯33°03′6″劃分采樣區(qū)域，南起湖北蘄春，北至河北安國，基本覆蓋了全國艾葉主要產(chǎn)地。經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠明教授鑒定為艾Levl.et Vant.，取樣部位均為其幼嫩葉片，總計36份樣品（表1），野生種和栽培種各有18種。所有材料在采樣前均經(jīng)過了去雜處理，以確保種質(zhì)純度。采集后封裝于有干燥劑的自封袋內(nèi)，放置入冰盒，并及時送至實(shí)驗(yàn)室用錫箔紙包裹浸入液氮，迅速冷凍后放入于?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 樣品生長環(huán)境信息

1.2 試劑與儀器

植物組織基因組DNA抽提試劑盒（生工生物公司，編號B518261）、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（生工生物公司，編號B518131）、Taq Plus DNA 聚合酶（BBI，編號B600090）、滅菌水。

SW-CJ-1D型潔凈工作臺（江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠）、PCR-96型PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀（BBI）、G508009型高速微量離心機(jī)（100～14 800 r/min，生工生物公司）、DYY-6C型電泳儀（北京六一公司）、FR980型凝膠成像系統(tǒng)（上海復(fù)日科技有限公司）。

2 方法

2.1 DNA提取與檢測

采用試劑盒（生工生物，批號B518261）法提取樣品葉片基因組DNA。

2.2 ISSR引物篩選及PCR反應(yīng)體系確定

以提取的艾基因組DNA為模板，從哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的100條引物[13]中篩選出16條引物，均能擴(kuò)增出清晰完整、多態(tài)性和穩(wěn)定性均較好的條帶。通過一系列實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，最終確定本實(shí)驗(yàn)的ISSR-PCR反應(yīng)體系為（50 μL）：10×PCR Buffer 5 μL，引物F 2 μL，引物R 2 μL，Dntp 2 μL,Taq Plus DNA Polymerase 0.5 μL，最后用滅菌水加至50 μL。擴(kuò)増反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，進(jìn)行35個循環(huán)；72 ℃延伸8 min；4 ℃保存。

2.3 ISSR-PCR擴(kuò)增及檢測

將需要使用的反應(yīng)體系取出，對所有樣品基因組DNA擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠在150 V 100 mA的電泳條件下電泳20 min，置于全自動凝膠成像分析系統(tǒng)上成像，調(diào)節(jié)至最佳光圈及亮度后拍照保存。

2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

將實(shí)驗(yàn)中所做出來的瓊脂糖凝膠膠板拍照，對膠板中的電泳條數(shù)進(jìn)行判讀。統(tǒng)計原則以瓊脂糖凝膠電泳上的每1個條帶當(dāng)成1個分子標(biāo)記，其所代表的意義為1個基因位點(diǎn)。對于不同產(chǎn)地的艾葉DNA樣品在瓊脂糖凝膠電泳統(tǒng)計時按照有條帶為1，無條帶為0；相同相對分子質(zhì)量中，以較為清晰的記為1不清晰的記為0，模糊條帶記為0的原則，在EXCEL中記錄成0、1矩陣形式。用Ntsyspc2.1對艾葉ISSR分子標(biāo)記統(tǒng)計好的0、1矩陣數(shù)據(jù)做UPGMA聚類分析。用POPGENEv1.32軟件對艾葉ISSR分子標(biāo)記統(tǒng)計好的0、1矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳學(xué)分析，得出它們的遺傳特征系數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 引物擴(kuò)增結(jié)果分析

以16條引物對36個不同產(chǎn)地的艾葉資源進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增（表2），共擴(kuò)增出402條清晰的條帶，其中多態(tài)性條帶有398條，多態(tài)性百分比為99%。16條引物擴(kuò)增出的有效條帶數(shù)范圍為17～31條，均值為24.875條。引物UBC840擴(kuò)增出的條帶最多，為33條，引物UBC822擴(kuò)增條帶最少，為17條（圖1～3）。ISSR擴(kuò)增結(jié)果表明艾種質(zhì)資源具有較為豐富的遺傳多樣性。

表2 ISSR引物擴(kuò)增結(jié)果

圖1 引物892瓊脂糖凝膠擴(kuò)增結(jié)果

圖2 引物822瓊脂糖凝膠擴(kuò)增結(jié)果

圖3 引物834瓊脂糖凝膠擴(kuò)增結(jié)果

3.2 不同產(chǎn)區(qū)艾野生種質(zhì)與栽培種質(zhì)遺傳多樣性分析

對ISSR引物電泳結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計后，通過POPGENEv1.32軟件對艾種質(zhì)資源栽培種與野生種的遺傳背景進(jìn)行分析，從2個資源的遺傳多樣性指數(shù)來看，遺傳多樣性指數(shù)栽培艾要略高于野生品，但遺傳多樣性差距并不顯著。等位基因數(shù)（number of alleles，a）、有效等位基因數(shù)（effective number of allele，e）、Nei’s 氏基因多樣性指數(shù)（Nei’s gene diversity index，h）、Shannon’s 信息指數(shù)（Shannon's information index，）等指標(biāo)結(jié)果見表3。對栽培種和野生種之間遺傳距離分析后發(fā)現(xiàn)，兩者之間的遺傳一致度接近于1.000 0，為0.989 1，遺傳距離較小，為0.011 0，表明兩者親緣關(guān)系接近，說明栽培種來自于野生種的馴化，且馴化時間并不很長，因此遺傳背景差異較小[14]。對人工栽培艾與野生艾種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳變異分析可以發(fā)現(xiàn)，有2.77%的遺傳分化存在于2個亞群間，在采樣過程中能夠觀察到同一采集點(diǎn)的每株艾的表型均略有不同，生物的表觀多樣性主要由基因決定，基因差異明顯則表觀形態(tài)多樣性會更加豐富，由于艾的人工馴化時間短，栽培品種并非嚴(yán)格意義上遺傳背景高度純合的品種，而是多為一些混合品種，故種內(nèi)遺傳分化程度高則使得在同一樣點(diǎn)單株表觀形態(tài)特性呈現(xiàn)多樣性。栽培種與野生種之間基因流（gene flow，m）為17.520 8，由于艾的繁殖更多是通過無性繁殖途徑實(shí)現(xiàn)，此處的基因流更多是反映野生種與栽培種兩者之間遺傳多樣性趨同的一種關(guān)系，即兩者遺傳背景差距并不大[15-17]。

表3 人工栽培艾與野生艾種質(zhì)資源遺傳多樣性

3.3 不同產(chǎn)區(qū)（不同緯度）艾遺傳多樣性分析

按照地理緯度，將本次采集的緯度差異相對較小的產(chǎn)地劃分為4個大的區(qū)域（表4），從這些樣本中共擴(kuò)增出396條多態(tài)性較為豐富的條帶，多態(tài)性位點(diǎn)占比98.51%，該擴(kuò)增結(jié)果表明不同緯度間艾具有較好的遺傳多樣性。通過POPGENEv1.32軟件對按表4方法劃分的不同區(qū)域艾種質(zhì)資源進(jìn)行分析，結(jié)果如表5所示，從遺傳多樣性指數(shù)來看，4個區(qū)域的艾葉之間具有顯著的遺傳多樣性。對4個區(qū)域資源進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳變異分析后發(fā)現(xiàn)，4個區(qū)域間艾種群基因多樣性指數(shù)（gene diversity index，t）為0.192 7、遺傳多樣性指數(shù)（genetic diversity index，s）為0.164 2、遺傳變異指數(shù)（genetic variation index，st）為0.147 9、m為2.881 8。由此表明在地理區(qū)劃上4個居群間的艾品種具有一定的基因交流。在地理區(qū)劃上4個居群間的艾葉具有一定的基因交流。對4個區(qū)域間遺傳距離分析后發(fā)現(xiàn)（表6），它們之間的遺傳一致度接近于1，遺傳距離較小，接近于0，表明這4個居群間親緣關(guān)系極近。再次證明了4個居群具有一定的聯(lián)系。利用PopGen對4個區(qū)域進(jìn)行聚類，由聚類圖（圖4）可知，中西部ZXB與南部NB親緣關(guān)系更為接近，被聚成第1類。中部ZB次之，與第1類單獨(dú)聚成第2類。北部BB遺傳分化最強(qiáng)，單獨(dú)與第2類聚為一類。按地理劃分的聚類結(jié)果顯示出不同區(qū)域間由南向北依次具有進(jìn)階相似性，即不同產(chǎn)區(qū)艾在緯度從南向北相互兩兩具有聯(lián)系，這表明各地區(qū)艾的親緣關(guān)系受自身生長的緯度和相鄰地域間的距離影響。

表4 不同產(chǎn)區(qū)不同緯度區(qū)劃

表5 不同產(chǎn)區(qū)區(qū)劃艾種質(zhì)資源遺傳變異結(jié)果

表6 不同緯度區(qū)域遺傳距離相似度

圖4 不同緯度區(qū)域聚類結(jié)果

4 討論

以篩選出的16條引物對36個不同產(chǎn)地的艾葉資源進(jìn)行擴(kuò)增，多態(tài)性百分比為99%。有效條帶數(shù)范圍為17～31條，均值為24.875條。擴(kuò)增結(jié)果表明艾種質(zhì)資源具有較為豐富的遺傳多樣性。在采集樣品的過程中也能夠看出田間艾草臨株之間的差異性，表明即便在同一地點(diǎn)生長的不同植株間也存在一定的差異[18-19]。植物遺傳多樣性的成因較為復(fù)雜，植物在不同環(huán)境下與不同異栽培物之間存在協(xié)同共存，通過蟲媒等繁殖途徑，與其他異栽培物進(jìn)行接觸，導(dǎo)致其出現(xiàn)了較高的遺傳多樣性。

從栽培種與野生種2個類型來看，其兩種生存狀態(tài)下的艾均具有豐富的遺傳多樣性。兩者之間的遺傳一致度接近于1，遺傳距離也很小，趨近于0，這表明人類對于艾的馴化歷史相對較短，人工栽培種和野生種之間尚未分化完全。由于艾的繁殖更多是通過無性繁殖途徑實(shí)現(xiàn)，因此栽培種與野生種之間存在的m為17.520 8時更多是反映野生種與栽培種兩者之間遺傳多樣性趨同的一種關(guān)系。即兩者遺傳背景差距并不大，親緣關(guān)系接近，有利于植物間育種。本研究在將緯度差異相對較小的采集地劃分為的4個大的區(qū)域時，發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性整體呈現(xiàn)出一種遞進(jìn)式的遺傳擴(kuò)散。由聚類結(jié)果表明，相鄰區(qū)域間艾葉兩兩聯(lián)系，說明艾葉遺傳距離與緯度有關(guān)，從側(cè)面也能反映出不同種質(zhì)艾葉間基因交流程度較大。其中，南部居群多樣性最為豐富，中西部和中部分別居于第2和第3位置，北部居群遺傳多樣性在4個居群中最低。根據(jù)艾葉4個居群的遺傳分析可以推斷出，艾的分布是由南部向中部、北部依次擴(kuò)散的。性狀表型是基因型和環(huán)境間互做的結(jié)果，河南中西部屬于伏牛山脈分布區(qū)域，其氣候多樣性強(qiáng)，生態(tài)類型復(fù)雜多變，由此為不同產(chǎn)區(qū)艾的生存和變異提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，而北部居群所在區(qū)域受北部大陸季風(fēng)影響較強(qiáng)，氣候類型較為單一，這也是其遺傳類型較少的主要原因[20-21]。

綜上可得，艾葉的遺傳多樣性與地理距離具有一定的相關(guān)性，種質(zhì)資源遺傳多樣性是育種的重要內(nèi)容之一，種質(zhì)資源遺傳多樣性越豐富越有利于新品種選育，種質(zhì)親緣關(guān)系越近越有利于植物間育種。本研究通過分子標(biāo)記技術(shù)為艾葉規(guī)范化種植及新品種選育工作奠定了一定的基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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ISSR analysis on genetic diversity offrom different habitats

YU Meng-juan, ZHAO Bo-yu, DONG Cheng-ming, LI Xun, XING Bing, LI Man

College of Pharmacy, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China

The genetic diversity analysis ofin different producing areas will lay the foundation for the standardized planting and selection of new varieties ofISSR molecular marker technology was used to amplify artemisia sylvestris samples from 36 different production areas, and then genetic analysis was performed using POPGENE v1.32 software to obtain their genetic characteristic coefficients. Ntsyspc2.1 was used to perform ISSR molecular marker results UPGMA cluster analysis.16 primers were selected, and a total of 402 bands were amplified, including 398 polymorphic bands, and the percentage of polymorphism was 99%.. After analyzing the genetic distance between the wild species and the wild species, it was found that the genetic identity between the two is 0.989 1 and the genetic distance is 0.011 0. The diversity index (t) is 0.192 7, the genetic diversity index (s) is 0.164 2, the genetic variation index (st) is 0.147 9, and the gene flow (m) is 2.881 8. NTSYSpc software performs a systematic cluster analysis on 4 regions. The 4 loci are divided into 2 categories, and there are certain genetic similarities between the two adjacent 4 loci.Artemisia oleifera is extremely rich in genetic diversity, the genetic relationship between cultivated and wild species is close, and the genetic background is small. The genetic characteristics ofexhibit a progressive genetic spread with changes in latitude. Among them, southern Henan has the most abundant population diversity, followed by central and western Henan and central Henan, and northern population has the lowest genetic diversity.

Artemisiae Argyi FoliumISSR molecular marker; genetic diversity; cultivated germplasm; wild germplasm; different latitudes

R286.12

A

0253 - 2670(2023)13 - 4306 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.023

2023-02-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81603232）

余孟娟（1997—），女，碩士研究生，從事中藥資源保護(hù)與開發(fā)研究。E-mail: 1600213809@qq.com

董誠明（1963—），E-mail: dcm663@sina.com

[責(zé)任編輯 時圣明]