魚腥草bZIP基因的鑒定與分析

蔡 偉，肖敬忠，余小麗，姚彩鳳，陳 蔓，曾安杰，李芙蓉，陳 遼，劉 雷*，付鴻博

魚腥草基因的鑒定與分析

蔡 偉1，肖敬忠3，余小麗3，姚彩鳳3，陳 蔓3，曾安杰3，李芙蓉3，陳 遼3，劉 雷3*，付鴻博2*

1. 綿陽師范學院資源環(huán)境工程學院，四川 綿陽 621000 2. 紅河學院生物科學與農(nóng)學學院，云南 蒙自 661199 3. 綿陽師范學院生命科學與技術學院，四川 綿陽 621000

篩選使魚腥草具有不同環(huán)境適應性的候選基因，為后續(xù)繁育出具有更強環(huán)境適應性的魚腥草品種奠定基礎。以魚腥草轉錄組數(shù)據(jù)為基礎，鑒定了基因家族成員，并對其理化性質(zhì)、系統(tǒng)進化樹、motif基序及在2個不同生態(tài)型魚腥草中的表達進行分析。共鑒定得到163個基因，編碼蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)量在115（HcbZIP48和HcbZIP149）～703 aa（HcbZIP97），超過53%的家族成員為堿性蛋白，超過84%的家族成員為不穩(wěn)定蛋白，所有家族成員均為親水性蛋白。二級結構中，161個家族成員是由α-螺旋、延伸鏈、β-折疊和無規(guī)則卷曲4部分構成，β-折疊所占比例最低，α-螺旋和無規(guī)則卷曲所占比例較高。系統(tǒng)進化樹分析將163個家族成員分成了9個類別，包括C、S、G、A、I、U、H、F和D，其中被歸到D類別中的基因數(shù)量最多共有35個，數(shù)量最少的為C類別僅有4個，沒有基因被歸類到E和B類別中。Motif基序分析發(fā)現(xiàn)，motif1（RLLQNRESARRSRLRKKAYVQELESSVAK）高度保守在每個家族成員中均鑒定到且構成了基因的保守結構域。不同類別下的基因其motif基序構成較為接近，且部分motif基序只存在特定類別的基因中。表達分析發(fā)現(xiàn)，在魚腥草7號藥材中表達的基因數(shù)量多于魚腥草6號藥材，同時也發(fā)現(xiàn)單獨在7號藥材中表達的基因數(shù)量也多于魚腥草6號藥材。共發(fā)現(xiàn)6個基因，、、、、和在6號和7號藥材中均呈現(xiàn)出較高的表達量。通過比較6號和7號的差異基因發(fā)現(xiàn)，共有96個差異表達基因，并將其分成了2大類，共63個差異基因在7號藥材中表達量較高，33個差異基因在6號藥材中表達量較高。共篩選出4個基因、、和作為魚腥草6號和7號2種材料能夠形成適應不同生態(tài)條件的候選基因。

魚腥草；生物信息學；差異表達基因；不同生態(tài)型；基因家族

植物在其生命周期經(jīng)常面臨不利的環(huán)境條件，如干旱，紫外線，極端溫度等。為了在這些具有挑戰(zhàn)性的環(huán)境中生存和茁壯成長，植物經(jīng)過多年的進化和適應，已經(jīng)發(fā)展出各種各樣的防御機制。深入了解這些機制將有助于育種者開發(fā)優(yōu)良品種，供生產(chǎn)實踐采用以更有效地應對氣候變化。轉錄因子（transcription factors）已被證明通過自我調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)下游靶基因表達在植物生長和發(fā)育中起關鍵作用[1]，并通過結合靶基因的啟動子參與主要成分來響應不同的脅迫[2]。基因是植物中最大的轉錄因子家族之一，其家族成員已經(jīng)在植物、動物和許多其他物種中被鑒定出來。含有大約70個氨基酸的bZIP結構域具有堿性區(qū)域（N-x7-R/K基序）和亮氨酸拉鏈區(qū)域[3]。轉錄因子主要分布在核蛋白植物中。從煙草中分離到基因，構建了NbbZIP28-GFP融合蛋白[4]，前體蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜分離并進入細胞核發(fā)揮作用[4]。轉錄因子家族主要識別ACGT的順式作用元件，例如ABRE、G-box、A-box和C-box作為啟動子區(qū)域[5]。隨著基因的克隆和功能的發(fā)現(xiàn)，由于其在非生物脅迫下具有重要的調(diào)節(jié)功能，受到了研究者的廣泛關注。在白樺的研究中，通過過表達后發(fā)現(xiàn)轉基因株系的耐鹽能力提升[6]。在用不同濃度PEG-6000處理糜子幼苗后，、、和這4個基因都表達量隨處理濃度的變化呈現(xiàn)顯著上調(diào)或下調(diào)，說明了轉錄因子參與了糜子干旱脅迫[7]。在玉米的研究中，隨著NaCl處理時間的延長和的表達量顯著升高，在低溫（4 ℃）處理時，的表達量隨處理時間的延長顯著升高，說明了轉錄因子參與玉米鹽和低溫脅迫[8]。在小麥的研究中，過表達可提高植株的耐熱性[9]，過表達可提高植株的耐鹽性[10]。綜上，轉錄因子在植物應對非生物脅迫，包括干旱、高鹽、低溫和高溫等方面具有重要作用。

魚腥草為蕺菜Thunb.干燥地上部分，是一種辛辣的，心形葉狀的多年生草本植物，具有很高的食用和藥用價值[11]。幼嫩的莖葉是桌上的一種特殊的蔬菜[12]。魚腥草地上部、地下部和地上部干花期的新鮮植物作為常見的藥用植物[13]，具有清熱解毒、祛痰止咳和鎮(zhèn)痛等功效[14-15]，同時魚腥草還是許多藥物的原料，可加工成西藥注射劑或稱為“中藥抗生素”的中成藥[16]，在抗菌、抗病毒方面具有良好的作用，是連花清瘟膠囊、抗病毒合劑的重要成分[17]。魚腥草由于其較強的環(huán)境適應性，廣泛分布于我國南方各省區(qū)，西北、華北地區(qū)及西藏等地區(qū)[18]，但由于各地區(qū)的生長環(huán)境差異較大，各地區(qū)的魚腥草無論是在外觀還是營養(yǎng)成分上都會存在著一定的差異，同樣也會存在不同的生態(tài)適應性[19]。本研究以2種不同生態(tài)類型的魚腥草（6號和7號）作為材料，以轉錄組數(shù)據(jù)為基礎挖掘魚腥草基因家族成員，以期篩選出使魚腥草6號和7號藥材具有不同環(huán)境適應性的候選基因，為后續(xù)繁育出具有更強環(huán)境適應性的魚腥草品種奠定基礎。

1 材料

共選取2種不同生態(tài)類型的魚腥草（6號和7號）作為實驗材料。2020年9月在雅安雨城區(qū)濆江南岸的老板山腳下收集到6號藥材。2020年9月在四川省溫江市惠和村收集到7號藥材。經(jīng)綿陽師范學院生命科學與技術學院羅明華教授鑒定為三白草科植物蕺菜Thunb.，樣本材料保存于該校生命科學與技術學院教學農(nóng)場，在相同的場地條件和水肥管理2年后，采集地上部分（莖和葉）儲存在?80 ℃冰箱用于進一步分析。

2 方法

2.1 轉錄組測序及差異表達基因分析

轉錄組測序由武漢邁特維爾生物科技有限公司完成，對于轉錄組測序結果，使用DESeq2方法對6號和7號2份材料進行差異表達分析，經(jīng)過差異分析后，需要用Benjamini-Hochberg方法修正多重假設檢驗的假設檢驗概率（值），以獲得錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）。差異表達基因的篩選條件為|log2Fold Change|≥1，F(xiàn)DR＜0.05。

2.2 魚腥草bZIP基因的鑒定

以轉錄組測序結果預測的蛋白序列為基礎進行魚腥草基因的鑒定，bZIP結構域序列（PF00170）下載于Pfam數(shù)據(jù)庫，以此來查詢序列以比對蛋白，通過hmmer3.0軟件來鑒定魚腥草基因并結合轉錄組使用iTAK軟件所預測出來的基因為候選魚腥草基因。利用NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫對所有候選基因的結構域進行驗證，最終確定魚腥草基因家族成員。

2.3 魚腥草bZIP基因的生物信息學分析

利用所鑒定的基因和已知擬南芥基因進行系統(tǒng)樹。擬南芥數(shù)據(jù)下載于TAIR數(shù)據(jù)庫，利用MEGA軟件的Neighbor- Joining方法（bootstrap replications＝1000，Model＝p-distance）構建系統(tǒng)進化樹。魚腥草基因的理化性質(zhì)和二級結構利用ProtParam和SOMPA在線數(shù)據(jù)庫進行分析。家族成員的保守結構域利用NCBI進行分析，利用TBtools軟件的Simple MEME Wrapper工具分析家族成員的motif基序，并利用TBtools軟件進行可視化。

2.4 魚腥草bZIP基因的表達分析

根據(jù)轉錄組數(shù)據(jù)繪制所鑒定得到的魚腥草表達量熱圖和Venn圖，并利用TBtools軟件進行可視化。將6號和7號2個材料中差異表達的基因進行K-means聚類分析，并利用邁維在線云平臺（https://cloud.metware.cn）實現(xiàn)可視化。

3 結果與分析

3.1 魚腥草bZIP基因家族成員進化樹分析

將所鑒定得到的163個魚腥草基因和擬南芥進行進化樹分析，并根據(jù)擬南芥的分類方式進行分類，結果表明，擬南芥基因共分成11個類別，包括C、S、G、A、I、U、E、H、F、B和D（圖1）。魚腥草基因被歸類到這11個類別中的9個，包括C、S、G、A、I、U、H、F和D，其中被歸到D類別中的基因數(shù)量最多共有35個，其次為A和I類別，分別有32和31個，被歸類到C、S、H和U類別中的基因數(shù)量均少于10個，數(shù)量最少的為C類別僅有4個，同時可以發(fā)現(xiàn)，沒有基因被歸類到E和B類別中。

圖1 魚腥草和擬南芥bZIP基因的進化樹分析

3.2 魚腥草bZIP基因家族成員的理化性質(zhì)分析

對所鑒定的163個魚腥草基因的理化性質(zhì)和二級結構進行分析（表1），編碼蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)量在115 aa（HcbZIP48和HcbZIP149）～703 aa（HcbZIP97），其中類別A中的32個蛋白的氨基酸數(shù)量均在400 aa左右，類別S中的7個蛋白的氨基酸數(shù)量較少，均在110～160 aa。在這163個HcbZIP蛋白中，相對分子質(zhì)量在13 090（HcbZIP48和HcbZIP149）～75 470（HcbZIP97）。等電點在4.60（HcbZIP159）～9.96（HcbZIP136），其中有76個蛋白的等電點小于7為酸性蛋白，有87個蛋白的等電點大于7為堿性蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)在28.24（HcbZIP15、HcbZIP23和HcbZIP151）～79.99（HcbZIP153），其中有25個蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)小于40為穩(wěn)定蛋白，有138個蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)大于40為不穩(wěn)定蛋白。脂肪族氨基酸指數(shù)在43.37（HcbZIP17）～105.32（HcbZIP08）。親水性系數(shù)在?1.284（HcbZIP30）～?0.065（HcbZIP79），表明所有的蛋白均為親水性蛋白。對二級結構預測后發(fā)現(xiàn)，共有161個HcbZIP家族成員由α-螺旋、延伸鏈、β-折疊和無規(guī)則卷曲4部分構成，HcbZIP30由α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲3部分構成，延伸鏈的占比為0，HcbZIP30由α-螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲3部分構成，β-折疊的占比為0。β-折疊在所有蛋白中的占比均較低，均低于10%，延伸鏈在所有蛋白中的占比均低于20%，α-螺旋的占比在15.67%（HcbZIP17）～84.17%（HcbZIP08），無規(guī)則卷曲的占比在9.57%（HcbZIP48）～75.00%（HcbZIP17）。

表1 魚腥草bZIP基因家族成員的理化性質(zhì)分析

續(xù)表1

續(xù)表1

3.3 魚腥草bZIP基因家族成員保守結構域及motif基序分析

將所鑒定得到的HcbZIP蛋白進行單獨進化樹構建（圖2-a），同樣分成了9個類別。通過分析基因的保守結構域發(fā)現(xiàn)，所鑒定的163個基因均有bZIP家族的保守結構域（圖3-c），進一步證實這些基因均屬于bZIP家族成員。為了分析bZIP家族成員的蛋白特征，對其motif基序及組成進行分析（圖2-b和圖3），共設定了20個motif基序，其中motif1在163個家族成員中均被鑒定到為最保守的motif基序，它也構成了家族成員的保守結構域，motif1（RLLQNRESARRSRLR- KKAYVQELESSVAK）由29個氨基酸位點組成。在類別C和U中的基因其motif基序結構簡單，只鑒定到了motif1。類別S中的基因motif基序結構也較為簡單，只包含motif1和motif11。類別A中的基因除了外的其他基因的motif基序組成均較為豐富，包含了8～9個motif基序，其中motif6、motif7、motif9和motif20只在類別A中的基因中鑒定到。Motif18（HIRHQRTSSES- FIFDEQPSWLNDLLDEPETPVGRGTHRRSSSDSV-AYLDI）和motif19（RRPAIKDWETIVDTCGY- QNSVASAREWLVEKHEADRSDMHAYGY）只在類別I的部分基因中被鑒定到。Motif5（MADTSPRTDTSTDGDLDDKNQRLDPGHSVM- AVASDSSDRSK）和motif12（FDKALGSFDTASAA- RILSQTQSLNQGQESNIPVLNSNFEKW）只在類別D和F的部分基因中被鑒定到。Motif8（ILVSHLEP- LTEQQLMGICNLQQSSQQAEDALSQGMEALQQS-LAETLASGS）只在類別D的部分基因中被鑒定到。

圖2 魚腥草bZIP蛋白進化樹(a)，motif基序(b)和保守結構域(c) 分析

圖3 魚腥草bZIP motif基序組成分析

3.4 魚腥草bZIP基因表達分析

根據(jù)轉錄組數(shù)據(jù)將所鑒定得到的163個基因在6號和7號藥材中的表達模式進行分析并繪制了表達量熱圖和Venn圖（圖4-A、B）。通過表達量熱圖（圖4-A）可以發(fā)現(xiàn)，基因在6號和7號魚腥草的中表現(xiàn)出不同的表達模式，在6號藥材中表達的基因共有142個，在7號藥材中表達的基因共有158個。共發(fā)現(xiàn)6個基因，包括、、、、和在6號和7號藥材中均呈現(xiàn)出較高的表達量，其中和在6號藥材中的FPKM值均超過100，和在7號藥材中的FPKM值超過100，在6號和7號藥材中所有的基因中表達量最高的均為。但大部分的基因的表達量較低，6號藥材中有41個基因的FPKM值小于1，7號藥材中有23個基因的FPKM值小于1。同時還發(fā)現(xiàn)1個基因在6號和7號藥材中均不表達。通過Venn圖（圖4-B）可以發(fā)現(xiàn)，在6號和7號中均表達的基因共有138個，只在7號藥材中表達的基因有20個，其中和的表達量相對較高，F(xiàn)PKM值大于10。只在6號藥材中表達的基因有4個且表達量均較低，其中有3個基因的FPKM值小于1。

圖4 魚腥草bZIP基因在6號和7號藥材中的表達模式分析(A) 和Venn圖(B)

3.5 不同生態(tài)品種中bZIP基因差異表達分析

為了進一步比較在不同生態(tài)型魚腥草材料中的表達差異，對6號和7號藥材中差異表達基因進行了分析，共有96個基因在6號和7號2個品種中呈現(xiàn)出差異表達。通過K-means聚類分析后可以發(fā)現(xiàn)（圖5），這96個基因被分成了2個類別，其中A類別中包括了63個差異基因，這63個基因表現(xiàn)出在7號藥材中的表達量與6號相比為上調(diào)，其中有多個基因是在6號藥材中不表達而與7號藥材形成差異且差異倍數(shù)較大，在2個材料中均表達而形成較大差異倍數(shù)的基因包括和。B類別中包括了33個差異基因，這33個基因表現(xiàn)出在7號藥材中的表達量與6號相比下調(diào)，其中是在7號藥材中不表達而與6號藥材形成的差異，有2個基因包括和在6號和7號藥材中均表達，但形成了較大的差異倍數(shù)。

圖5 魚腥草6號和7號藥材中差異表達的bZIP基因分析

4 討論

轉錄因子是植物中最大和最多樣化的家族之一[20]。目前，基因家族已在許多物種中被鑒定，在西瓜[21]和文冠果[20]中分別鑒定得到62和64個基因家族成員，分析后發(fā)現(xiàn)這2個物種中均有14對節(jié)段復制事件。在葡萄的研究中發(fā)現(xiàn)[22]，共鑒定到55個基因家族成員，同樣存在14對節(jié)段復制事件。在蘋果[23]和大豆[24]的研究中分別鑒定到112和160個基因家族成員，在這2個物種中發(fā)現(xiàn)了更多的節(jié)段復制和串聯(lián)復制事件。這些也表明節(jié)段復制和串聯(lián)復制均對基因家族成員的擴增具有很大的貢獻。在本研究中，共鑒定得到163個基因家族成員，由于魚腥草基因組數(shù)據(jù)測序還未完成，本研究是基于轉錄組數(shù)據(jù)進行的家族成員鑒定，因此無法直接判斷基因家族成員擴增的具體原因，通過以上前人的結果推測魚腥草基因同樣存在著數(shù)量較多的節(jié)段和串聯(lián)復制事件。魚腥草在長時間的不斷進化過程中需要適應環(huán)境變化帶來的生存壓力，由于對非生物脅迫具有重要的作用，需要存儲環(huán)境信息，因此可能也導致了基因的產(chǎn)生、復制和進化。

為了進一步研究魚腥草基因的進化和起源，用擬南芥和魚腥草基因進行了系統(tǒng)發(fā)生樹分析，結果顯示163個HcbZIP蛋白分為9個類別，包括C、S、G、A、I、U、H、F和D，每個類別都包含一個或多個基因。該分類類似于擬南芥[25]，文冠果[20]和柳枝稷[26]。A類別的大多數(shù)功能信息提示在脫落酸或應激信號中的作用。因此，A類別的s在種子和營養(yǎng)組織中似乎都是ABA信號轉導的重要參與者[25]。本研究共有32個基因被分到類別A中，其中在2個材料中的表達量較高且差異較大，推著該基因可能參與到魚腥草ABA信號轉導途徑。S類別是擬南芥最大的類別之一，在脅迫處理后也被轉錄激活或在花的特定部分特異表達[25]。擬南芥家族中的S類別的基因在響應低溫和干旱有重要作用[27]，本研究中共有7個基因被分到S類別下，其中與6號藥材相比在7號中下調(diào)表達，、、和在7號中上調(diào)表達，推測這些基因可能影響6號和7號魚腥草對低溫和干旱的響應差異。

在植物發(fā)育和應對不同生存環(huán)境方面起著重要作用。例如，幾個水稻基因如被鑒定為對冷脅迫反應的調(diào)節(jié)因子[28]。西瓜的和可能在保護植物免受線蟲感染和低溫脅迫方面發(fā)揮重要作用[21]。文冠果中的有多個基因?qū)}脅迫和凍害都有反應，而和對脫落酸和低溫都有反應[20]。在馬鈴薯中和在不同環(huán)境中均有高表達且穩(wěn)定表達[29]。有研究發(fā)現(xiàn)，幾個基因在冷處理后上調(diào)或下調(diào)表達[30]。本研究選用了原產(chǎn)地具有不同生態(tài)類型的魚腥草6號和7號藥材，6號和7號魚腥草在表觀形態(tài)上具有明顯的差異，同時通過我們前期測定的相關生理數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，它們在多種代謝物含量具有明顯差異，包括黃酮類物質(zhì)，生物堿類物質(zhì)，揮發(fā)性代謝物，這些物質(zhì)上的差異均導致了這2個藥材具有明顯的差異。通過對基因在6號和7號魚腥草中的表達情況進行分析，所鑒定到的163個基因中有142個在6號藥材中表達，有158個在7號藥材中表達，同時還發(fā)現(xiàn)，只在7號藥材中表達的基因有20個，只在6號藥材中表達的基因有4個。為了比較2個品種中表達差異，篩選得到96個差異表達基因，7號與6號相比，有63個基因在7號中表達上調(diào)，33個表達下調(diào)。結合表觀形態(tài)、生態(tài)條件、物質(zhì)含量及表達量的差異篩選出、、和這4個基因?qū)⒆鳛?號和7號魚腥草能夠適應低溫和干旱等不良環(huán)境的候選基因，為研究魚腥草抗非生物脅迫的分子基礎及相關抗性品種的選育提供理論數(shù)據(jù)

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Identification and analysis ofgene of

CAI Wei1, XIAO Jing-zhong3, YU Xiao-li3, YAO Cai-feng3, CHEN Man3, ZENG An-jie3, LI Fu-rong3, CHEN Liao3, LIU Lei3, FU Hong-bo2

1. School of Resources and Environmental Engineering, Mianyang Normol University, Mianyang 621000, China 2. College of Biological and Agricultural Sciences, Honghe University, Mengzi 661199, China 3. College of Life Science & Biotechnology, Mianyang Normol University, Mianyang 621000, China

To lay a foundation for further study ofgene.Based on the transcriptome data of, we identified the HcbZIP family genes and analyzed their physicochemical properties, phylogenetic tree, motif compositions and the expressions in two different ecotype.A total of 163genes were identified. The number of amino acids encoding proteins ranged from 115 aa (and) to 703 aa (). More than 53% of the family members were basic proteins, and more than 84% of the family members were unstable proteins, all members of the family were hydrophilic proteins. In the secondary structure, 161 family members are composed of four parts: alpha helix, extended strand, beta turn and random coil. The ratio of beta turn was the lowest, and the ratio of alpha helix and random coil were the highest. Phylogenetic tree analysis divided these 163 family members into 9 classes, including C, S, G, A, I, U, H, F and D, the largest number was in class D with the number of 35, the lowest number was in classes C with only four, and nogenes were classified into classes E and B. Motif composition analysis revealed that motif 1 (RLLQNRESARRSRLRKKA- YVQELESSVAK) was highly conserved in each family member and constitutes a conserved domain of thegene. The motifs of the genes in different classes were close, and part of the motifs only existed in the genes in specific classes. The expression analysis showed that the number ofgene expressed in 7# was more than that in 6#, it was also found that the number ofgene only expressed in 7# was more than that in 6#. A total of 6genes including,,,,, andwere highly expressed in 6# and 7#. By comparing the differentially expressedgenes of 6# and 7#, we found that a total of 96 differentially expressedgenes, which were divided into 2 classess, and 63 differentially expressed genes were highly expressed in 7#, the expression level of the other 33 differentially expressed genes were higher in 6#.A total of 4 genes, including,,andwere selected as candidate genes that can adapt to different ecological conditions for these two materials.

Houttuynia cordata Thunb.; bioinformatics; differentially expressed gene; different ecotypes; genes family

R286.12

A

0253 - 2670(2023)13 - 4295 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.022

2022-12-06

四川省科技計劃項目（2021YJ0115）；四川省科技計劃項目（2020YFN0113）

蔡 偉（1989—），碩士，助教，主要從事環(huán)境生物學、植物資源評價與利用研究，Tel: 15983684595 E-mail: 708810337@qq.com

通信作者：劉 雷（1980—），碩士，副研究員，主要從事藥用植物資源評價與利用、農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化與標準化研究。E-mail: 33020897@qq.com

付鴻博（1987—），博士，講師，主要從事植物種質(zhì)資源創(chuàng)新與分子育種。E-mail: 113311168@qq.com

[責任編輯 時圣明]