靶向銅死亡相關(guān)基因治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎生物信息學(xué)分析及干預(yù)中藥的預(yù)測(cè)

楊會(huì)軍，郭 響，李偉青，蘇小軍，田雪梅，王海東，金芳梅*

·數(shù)據(jù)挖掘與循證醫(yī)學(xué)·

靶向銅死亡相關(guān)基因治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎生物信息學(xué)分析及干預(yù)中藥的預(yù)測(cè)

楊會(huì)軍1，郭 響2，李偉青1，蘇小軍1，田雪梅1，王海東1，金芳梅1*

1. 甘肅省中醫(yī)院 風(fēng)濕骨病中心，甘肅 蘭州 730050 2. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310003

探索銅死亡相關(guān)基因在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）中的表達(dá)及其作用機(jī)制，并篩選通過靶向銅死亡基因治療RA的潛在中藥。通過檢索GEO數(shù)據(jù)庫獲得RA芯片數(shù)據(jù)，分析銅死亡基因在RA中表達(dá)水平；依據(jù)銅死亡基因表達(dá)情況構(gòu)建高表達(dá)亞型和低表達(dá)亞型，并進(jìn)行差異分析，篩選出與RA相關(guān)的銅死亡基因。按不同分組對(duì)基因表達(dá)矩陣進(jìn)行免疫浸潤(rùn)分析，并分析免疫浸潤(rùn)細(xì)胞與銅死亡基因之間的相關(guān)性。利用Kobas在線工具對(duì)差異基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。通過Herb數(shù)據(jù)庫檢索靶向銅死亡基因治療RA的潛在中藥及其有效成分，使用Autodock vina軟件模擬藥物與銅死亡靶蛋白結(jié)合活性。通過收集臨床樣本驗(yàn)證銅死亡相關(guān)基因在RA中表達(dá)水平。、、、、、和7個(gè)銅死亡相關(guān)基因在RA中差異表達(dá)。免疫浸潤(rùn)分析結(jié)果顯示，在RA中活化的記憶CD4+T細(xì)胞、靜息自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞和中性粒細(xì)胞與銅死亡相關(guān)。富集分析結(jié)果顯示，銅死亡主要與趨化因子信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、核因子-κB信號(hào)通路、p53信號(hào)通路和過氧化物酶體增殖物激活受體信號(hào)通路相關(guān)。虎杖葉可能是靶向銅死亡基因治療RA的潛在中藥。分子對(duì)接結(jié)果顯示，虎杖葉有效成分均有與銅死亡靶蛋白結(jié)合的可能。、、、在RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平升高。銅死亡相關(guān)基因表達(dá)水平與RA病程進(jìn)展相關(guān)，并預(yù)測(cè)虎杖葉是潛在靶向銅死亡基因治療RA的藥物，為RA的臨床診療及藥物開發(fā)提供了新的方向和理論基礎(chǔ)。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；銅死亡相關(guān)基因；免疫浸潤(rùn)；生物信息學(xué)；虎杖葉；二氫硫辛酰胺脫氫酶；谷氨酰胺酶；鐵氧還原蛋白1；二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙酰化酶

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是臨床上常見的一種炎癥性疾病，癥狀主要表現(xiàn)為持續(xù)性疼痛、壓痛和關(guān)節(jié)破壞[1]。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為RA屬于“痹證”范疇，主要因氣血痹阻，經(jīng)脈不通而痛；氣行不暢而痹阻經(jīng)絡(luò)；血瘀氣阻而化熱[2]。目前我國RA患病率約0.42%，全球患病率約0.27%[3-4]。RA作為慢性疾病已成為全世界關(guān)注的公共衛(wèi)生問題之一。RA的標(biāo)準(zhǔn)治療手段主要用于控制炎癥和關(guān)節(jié)疼痛，但常用的非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、改善病情的抗風(fēng)濕藥物和生物制劑長(zhǎng)期服用會(huì)引起不良反應(yīng)[4-5]。因此，尋找安全、有效的治療藥物或治療策略對(duì)RA臨床治療具有重要意義。RA的病理過程受T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞等免疫細(xì)胞與成纖維樣滑膜細(xì)胞之間的串?dāng)_影響[6]。免疫細(xì)胞的激活會(huì)分泌多種炎癥因子，進(jìn)而影響軟骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞導(dǎo)致軟骨損傷和骨骼破壞[5-6]。干預(yù)這些免疫細(xì)胞或免疫因子作為RA治療相關(guān)研究的新方法和新靶點(diǎn)具有很大的潛力，相關(guān)的治療方案仍在研究中[6]。

細(xì)胞死亡與RA的疾病發(fā)展密切相關(guān)。如成纖維樣滑膜細(xì)胞死亡減少導(dǎo)致滑膜細(xì)胞過度增殖，從而引發(fā)滑膜炎[7]。自身免疫性T細(xì)胞和B細(xì)胞的細(xì)胞死亡失衡也會(huì)增加自身免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)[8]。隨著細(xì)胞死亡研究領(lǐng)域的快速發(fā)展，針對(duì)RA細(xì)胞死亡的相關(guān)臨床治療策略也取得了一定的進(jìn)展[7-8]。銅死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式，其機(jī)制與線粒體呼吸相關(guān)[7]。銅離子通過與三羧酸循環(huán)過程中的脂酰化蛋白質(zhì)結(jié)合，使脂酰化蛋白聚集導(dǎo)致鐵硫簇蛋白丟失，進(jìn)而誘發(fā)蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激并造成細(xì)胞死亡[7,9]。相關(guān)研究結(jié)果顯示RA患者血液中銅含量升高，且與炎癥標(biāo)志物呈正相關(guān)[10]。銅死亡相關(guān)基因丙酮酸脫氫酶E1 α1亞基（pyruvate dehydrogenase E1 subunit alpha 1，）可能與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）協(xié)同調(diào)節(jié)RA中的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，且銅死亡另一相關(guān)基因丙酮酸脫氫酶E1亞基β（pyruvate dehydrogenase E1 subunit beta，）可能與成纖維樣滑膜細(xì)胞的異常增殖相關(guān)[11]。由此可見，闡明銅死亡在RA發(fā)病過程中的作用機(jī)制并探尋相關(guān)治療藥物具有重要的研究意義。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥是中華文化的瑰寶，治療RA已有近千年歷史。臨床上中醫(yī)主要通過祛風(fēng)除濕、散瘀活血、通絡(luò)止痛來消除痹癥，代表性的復(fù)方有蠲痹湯、獨(dú)活寄生湯、烏頭湯和桂枝芍藥知母湯[2,12]。有實(shí)驗(yàn)表明傳統(tǒng)中藥及其有效成分可以通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞異常增殖和抗炎等作用緩解RA癥狀[2,13]。然而中藥及其活性成分能否通過靶向銅死亡治療RA尚未見相關(guān)研究報(bào)道。本研究旨在通過生物信息學(xué)方法闡明銅死亡相關(guān)基因在RA中的表達(dá)及作用機(jī)制，篩選靶向銅死亡相關(guān)基因的中藥及其活性成分。為明確銅死亡在RA中的調(diào)控機(jī)制并開發(fā)用于防治RA的靶向調(diào)節(jié)藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 銅死亡相關(guān)基因集獲取

以“cuproptosis”和“銅死亡”為關(guān)鍵詞分別檢索PubMed數(shù)據(jù)庫（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）和中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫（https://www.cnki.net/）截至2022年9月30日收錄的與銅死亡相關(guān)文獻(xiàn)，構(gòu)建銅死亡相關(guān)基因集。共獲得10個(gè)與銅死亡密切相關(guān)的基因：細(xì)胞周期依賴性激酶抑制基因（cell cycle-dependent kinase inhibitory gene，）、鐵氧還原蛋白1（ferridoxin 1，）、二氫硫辛酰胺脫氫酶（dihydrolipoamide dehydrogenase，）、二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙酰化酶（dihydrolipoamide acetyltransferase，）、硫辛酸合成酶（lipoic acid synthetase，）、谷氨酰胺酶（glutaminase，）、脂酰轉(zhuǎn)移酶1（lipoyltransferase 1，）、金屬調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子1（metal regulatory transcription factor 1，）用于后續(xù)分析[9]。

1.2 RA滑膜基因表達(dá)數(shù)據(jù)集獲取

以“rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞檢索由美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）創(chuàng)建并維護(hù)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），獲取RA基因表達(dá)數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)集篩選要求：（1）數(shù)據(jù)集包含RA組和正常對(duì)照組，且每組樣本量不少于3；（2）RA組未經(jīng)藥物或其他手段干預(yù)治療；（3）數(shù)據(jù)集信息完整無缺失。

1.3 RA樣本分型

基于銅死亡相關(guān)基因在GEO數(shù)據(jù)集RA樣本中的表達(dá)水平，使用Consensus Cluster Plus R語言包對(duì)所有RA樣本進(jìn)行表達(dá)一致性聚類分析，將樣本分為銅死亡基因表達(dá)模式不同的亞型。

1.4 基因表達(dá)差異分析

通過RStudio 2022.02.1軟件的“Limma”R語言包，對(duì)檢索得到的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集根據(jù)不同分組進(jìn)行基因表達(dá)差異分析。以差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）絕對(duì)值大于2及矯正后＜0.05為差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG）篩選標(biāo)準(zhǔn)。差異分析結(jié)果通過微生信（https://www. bioinformatics.com.cn/）在線網(wǎng)頁工具對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.5 免疫浸潤(rùn)分析

基于基因表達(dá)數(shù)據(jù)矩陣使用CIBERSORT去卷積法評(píng)估每個(gè)樣本中22種免疫細(xì)胞占比。比較不同分組間（正常對(duì)照組RA組、RA1組RA2組）22種免疫細(xì)胞豐度差異。

1.6 富集分析

將需要分析的基因簡(jiǎn)稱導(dǎo)入在線網(wǎng)頁工具Kobas（http://bioinfo.org/kobas）進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。分析物種設(shè)置為“智人（homo sapiens）”，以＜0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 潛在治療中藥預(yù)測(cè)

對(duì)在RA病理過程中發(fā)揮重要作用的銅死亡相關(guān)基因，通過本草圖鑒數(shù)據(jù)庫（HERB，http://herb.ac.cn/）檢索其相應(yīng)中藥。針對(duì)涵蓋靶點(diǎn)較多的中藥，通過檢索相關(guān)文獻(xiàn)，確定其有效成分。通過SwissADME在線工具（http://www.swissadme. ch）依據(jù)里賓斯基五規(guī)則（Lipinski’s rule of five，RO5）篩選出成藥性較好的有效成分，并使用ProTox-II在線工具對(duì)有效成分進(jìn)行安全性評(píng)估[14]。借助AutoDockTools 1.5.6軟件模擬中藥有效成分結(jié)合銅死亡相關(guān)基因，預(yù)測(cè)其治療RA的潛在可能。

1.8 臨床樣本收集

本研究獲得甘肅省中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)2020-031-01），所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。本研究于甘肅省中醫(yī)院共收集5例健康志愿者外周血樣本（健康對(duì)照組）及5例臨床診斷為RA患者（RA組）外周血樣本，所有外周血樣本通過提取試劑分離出單核細(xì)胞，放入?80 ℃冰箱保存。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）RA組患者經(jīng)臨床醫(yī)生診斷符合2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)聯(lián)合歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟提出的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）RA組患者處于RA疾病活動(dòng)期；（3）年齡18～80歲；（4）性別不限；（5）簽署知情同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有精神疾病或其他原因無法配合者；（2）合并其他急慢性疾病者；（3）近期有生育要求或正處于妊娠期或哺乳期的女性；（4）入組前4周內(nèi)使用過藥物干預(yù)治療者。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量-PCR（real-time fluorescence quantification-PCR，RT-qPCR）分析

通過Trizol法提取外周血樣本單個(gè)核細(xì)胞總RNA，檢測(cè)濃度后取1000 ng RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（Takara，RR047A）。引物序列如表1所示，使用SYBR green染料（諾唯贊，批號(hào)Q141-02）按20 μL體系進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。t值以磷酸甘油醛脫氫酶（reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參按2???Ct法分析。

表1 引物序列

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 銅死亡相關(guān)基因在RA中表達(dá)情況

通過檢索GEO數(shù)據(jù)庫得到物種為人的RA滑膜基因表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE89408。數(shù)據(jù)集基于芯片GPL11154，包括對(duì)照組樣本28例，RA樣本152例。基于GSE89408數(shù)據(jù)集，10個(gè)銅死亡相關(guān)基因表達(dá)差異分析結(jié)果顯示（圖1-A），與正常對(duì)照組相比，RA組關(guān)節(jié)滑膜、、、、、、、和表達(dá)上調(diào)且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。

2.2 銅死亡相關(guān)基因表達(dá)分型

基于10個(gè)銅死亡相關(guān)基因在RA樣本關(guān)節(jié)滑膜表達(dá)情況，將152例RA滑膜樣本進(jìn)行一致性聚類分析（圖1-B），分為RA1和RA2 2種亞型。主成分分析（principal component analysis，PCA）結(jié)果顯示（圖1-C），RA1與RA2 2種亞型間存在差異，可用于進(jìn)一步分析。銅死亡相關(guān)基因在RA1和RA2 2種亞型表達(dá)差異分析結(jié)果顯示（圖1-D），與RA1組相比，RA2組、、、、、、、和表達(dá)下調(diào)且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。

2.3 差異分析結(jié)果

基于數(shù)據(jù)集GSE89408將RA組與正常對(duì)照組相比，根據(jù)DEGs篩選條件，共得到10 558個(gè)RA滑膜DEGs（圖2-A）。銅死亡2個(gè)亞型RA1與RA2分組間差異分析共得到652個(gè)DEGs（圖2-B）。對(duì)2次差異分析結(jié)果進(jìn)行交集分析，得到501個(gè)共同DEGs。

2.4 通路富集分析結(jié)果

501個(gè)共同DEGs通路分析結(jié)果（圖2-C）顯示，趨化因子（chemokine）信號(hào)通路、Toll樣受體（Toll-like receptor）信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路、p53信號(hào)通路和過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisomeproliferators-activated receptor，PPAR）信號(hào)通路與銅死亡相關(guān)，在RA病理過程中發(fā)揮重要作用。

2.5 免疫浸潤(rùn)分析結(jié)果

免疫浸潤(rùn)分析結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比（圖3-A），RA組關(guān)節(jié)滑膜樣本中記憶B細(xì)胞（B cell memory，＜0.001）、漿細(xì)胞（plasma cells，＜0.05）、未活化的記憶CD4+T細(xì)胞（T cells CD4 memory resting，＜0.000 1）、活化的記憶CD4+T細(xì)胞（T cells CD4 memory activated，＜0.000 1）、濾泡輔助性T細(xì)胞（T cells follicular helper，＜0.05）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T cells regulatory，＜0.000 1）、γδT細(xì)胞（T cells gamma delta，＜0.05）、靜息自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞（NK cells resting，＜0.01）、活化NK細(xì)胞（NK cells activated，＜0.000 1）、單核細(xì)胞（monocytes，＜0.05）、M1型巨噬細(xì)胞（macrophages M1，＜0.000 1）、靜息樹突細(xì)胞（dendritic cells resting，＜0.05）、靜息肥大細(xì)胞（mast cells resting，＜0.01）和中性粒細(xì)胞（neutrophils，＜0.000 1）豐度存在差異。

RA1組與RA2組免疫浸潤(rùn)分析結(jié)果（圖3-B）顯示，兩組間初始CD4+T細(xì)胞（T cells CD4 naive，＜0.01）、活化的記憶CD4+T細(xì)胞（＜0.05）、靜息NK細(xì)胞（＜0.05）、M2型巨噬細(xì)胞（macrophages M2，＜0.001）、嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophils，＜0.05）和中性粒細(xì)胞（＜0.01）豐度存在差異。

2.6 銅死亡相關(guān)基因診斷價(jià)值分析

結(jié)合在正常對(duì)照組與RA組及RA1與RA2組間差異表達(dá)的銅死亡相關(guān)基因，共有8個(gè)共同銅死亡相關(guān)基因（、、、、、、和）表達(dá)存在差異。借助微生信在線網(wǎng)頁工具構(gòu)建基因受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線，獲得基因?qū)A診斷的靈敏度和特異度，評(píng)估基因?qū)A診斷價(jià)值。結(jié)果（圖4）顯示，（AUC＝0.862）、（AUC＝0.826）、（AUC＝0.880）、（AUC＝0.901）、LIAS（AUC＝0.852）、LIPT1（AUC＝0.851）和PDHB（AUC＝0.857）特異性較高。此外，PDHA1（AUC＝0.658）特異性較低。

A-銅死亡相關(guān)基因在正常對(duì)照組和RA組表達(dá)水平，與正常對(duì)照組比較：*P＜0.05 ***P＜0.001 ****P＜0.000 1；B-基于銅死亡相關(guān)基因表達(dá)水平對(duì)RA樣本聚類分析；C-RA不同亞型組PCA分析結(jié)果；D-RA不同亞型組銅死亡相關(guān)基因表達(dá)水平，與RA1組比較：****P＜0.000 1

2.7 相關(guān)性分析結(jié)果

7個(gè)共同銅死亡相關(guān)基因與3個(gè)共同差異免疫細(xì)胞（活化的記憶CD4+T細(xì)胞、靜息NK細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）相關(guān)性分析結(jié)果如圖5所示，、、、、、和之間表達(dá)相關(guān)性均為正相關(guān)（＞0.05）。活化的記憶CD4+T細(xì)胞與7個(gè)銅死亡相關(guān)基因表達(dá)均呈正相關(guān)。與之相反，靜息NK細(xì)胞與7個(gè)銅死亡相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性系數(shù)均小于0。中性粒細(xì)胞與7個(gè)銅死亡相關(guān)基因表達(dá)相關(guān)性較弱。

2.8 靶向銅死亡基因治療RA的潛在中藥及其有效成分確定

基于Herb數(shù)據(jù)庫檢索能靶向7個(gè)共同銅死亡相關(guān)基因的潛在中藥，其中未能找到能靶向、和基因的中藥，潛在靶向、、和基因的治療RA的中藥如表2所示。通過檢索相關(guān)文獻(xiàn)確定中藥的有效成分，無相關(guān)文獻(xiàn)則通過Herb數(shù)據(jù)庫補(bǔ)充。共獲得7種潛在中藥（草莓車軸草、虎杖葉、白罌粟、麗春花果實(shí)、水團(tuán)花、粟殼和罌粟嫩苗），并確定41種有效成分。

A-正常對(duì)照組與RA組差異分析火山圖；B-RA1組與RA2組差異分析火山圖，藍(lán)色代表表達(dá)下調(diào)基因，紅色代表表達(dá)上調(diào)基因，灰色代表無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異基因；C-RA不同亞型組差異基因與RA相關(guān)基因韋恩圖；D-交集基因相關(guān)通路

2.9 分子對(duì)接模擬藥物分子與蛋白結(jié)合

通過SwissADME在線工具共篩選出符合RO5原則的藥物成分13種（表3），安全性評(píng)估結(jié)果顯示咖啡酸、庫明吉啶、大黃素、考邁斯托醇、阿魏酸、沒食子酸和白藜蘆醇毒性較低（毒性等級(jí)＞3，出現(xiàn)毒性反應(yīng)數(shù)≤1）。以甲氨蝶呤為陽性對(duì)照。將以上7個(gè)安全性較高的成分與7個(gè)共同銅死亡相關(guān)基因進(jìn)行分子對(duì)接，藥物分子配體與蛋白受體結(jié)合能如圖6-A所示。結(jié)合能均小于0，表明藥物分子與蛋白受體有結(jié)合可能。盡管嗎啡與DLAT結(jié)合能最低，但鑒于嗎啡屬于危險(xiǎn)藥物，成為RA治療藥物可能性較低。本研究展示其他結(jié)合能較低的構(gòu)象。DLD與大黃素結(jié)合構(gòu)象、庫明吉啶與FDX1結(jié)合構(gòu)象如圖6-B、C所示。

2.10 兩組受試者基線資料

最終正常對(duì)照組和RA組各納入5例受試者。兩組受試者基線資料如表4所示。

2.11 銅死亡相關(guān)基因在RA患者中mRNA表達(dá)水平

銅死亡相關(guān)基因、、、在健康受試者和RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平如圖7所示。與健康對(duì)照組相比，RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中、、、的mRNA表達(dá)水平明顯升高且差異具有統(tǒng)計(jì)差異（＜0.05、0.01）。

3 討論

銅死亡是新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞死亡方式，可能會(huì)影響RA中的各種細(xì)胞，從而涉及炎癥、血管生成和骨破壞的發(fā)展過程[11]。本研究通過下載GEO芯片數(shù)據(jù)，對(duì)RA滑膜基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，大部分銅死亡相關(guān)基因在RA患者樣本中表達(dá)上調(diào)，這表明銅死亡與RA的疾病進(jìn)展相關(guān)。基于銅死亡基因在RA樣本中的表達(dá)水平，將RA樣本分為銅死亡基因高表達(dá)亞型組和低表達(dá)亞型組。對(duì)正常對(duì)照組與RA組、銅死亡基因高表達(dá)組與低表達(dá)組分別進(jìn)行免疫浸潤(rùn)分析，確定了RA中3個(gè)與銅死亡相關(guān)的免疫細(xì)胞，分別為活化的記憶CD4+T細(xì)胞、靜息NK細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。大量記憶CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞存在于RA患者外周血、關(guān)節(jié)滑膜與滑液中，這些細(xì)胞能夠高效地產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥，同時(shí)促進(jìn)骨破壞[17-18]。同樣在RA環(huán)境中，中性粒細(xì)胞表達(dá)多種趨化因子受體，并釋放大量炎癥介質(zhì)[19]。因此，靶向抑制這些免疫細(xì)胞，降低促炎細(xì)胞因子水平是一種有前景的RA治療策略[5]。銅死亡基因與免疫細(xì)胞可能在RA免疫浸潤(rùn)方面發(fā)揮重要作用，能否通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞死亡緩解RA癥狀，有待進(jìn)一步研究。

A-正常對(duì)照組vs RA組 B-RA1組vs RA2組 *P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001 ****P＜0.000 1

基于差異分析共得到501個(gè)DEGs，KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，RA中銅死亡可能與趨化因子信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、p53信號(hào)通路和PPAR信號(hào)通路相關(guān)。NF-κB信號(hào)通路是細(xì)胞因子與炎癥反應(yīng)之間的橋梁，銅元素可以通過激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)炎癥和線粒體自噬障礙[20]。在長(zhǎng)期銅暴露或銅誘導(dǎo)的條件下，p53表達(dá)增加且腫瘤壞死因子信號(hào)通路被激活，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡[21-22]。Liu等[23]研究顯示，銅元素可能通過激活PPAR信號(hào)通路調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。PPAR也已被證實(shí)對(duì)CD4+T細(xì)胞的存活、激活和分化具有調(diào)節(jié)作用[24]。在RA中，各種趨化因子通過靶向中性粒細(xì)胞、成骨細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等促進(jìn)血管生成，加重關(guān)節(jié)滑膜炎癥，并使關(guān)節(jié)長(zhǎng)期處于慢性炎癥環(huán)境中[25]。此外，IL-17通過與其受體結(jié)合刺激TNF-α、IL-1β、IL-6和趨化因子產(chǎn)生，以及NF-κB活化[25]。而NF-κB通路被認(rèn)為是RA炎癥反應(yīng)的主要途徑之一[26]。由此可見，通過干預(yù)銅死亡相關(guān)通路促進(jìn)促炎細(xì)胞群銅死亡可以有效緩解RA炎癥。

圖4 銅死亡相關(guān)基因ROC曲線

圖5 相關(guān)性分析結(jié)果

表2 靶向銅死亡基因治療RA的潛在中藥

表3 潛在治療RA藥物成分化學(xué)性質(zhì)與毒性參數(shù)

Y-出現(xiàn)毒性反應(yīng) N-無毒性反應(yīng)

Y-toxic reaction occurs N-no toxic reaction occurs

A-潛在治療藥物與靶點(diǎn)蛋白分子對(duì)接結(jié)合能 B-DLD與大黃素結(jié)合構(gòu)象 C-庫明吉啶與FDX1結(jié)合構(gòu)象

表4 兩組受試者基線資料

HC-健康對(duì)照組 RA-RA組 與HC組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

銅死亡基因在RA芯片數(shù)據(jù)中表達(dá)分析結(jié)果顯示，、、、、、和7個(gè)基因在2次差異分析中均為差異表達(dá)基因，提示其可能是靶向銅死亡干預(yù)RA的重要基因。目前尚無在RA中的研究報(bào)道，主要促進(jìn)糖酵解和脂肪酸氧化，并改變氨基酸代謝參與炎癥反應(yīng)[27]。主要與線粒體功能、氧化應(yīng)激和炎癥有關(guān)，過表達(dá)可以增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）的數(shù)量并減少了T細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制NF-κB活性，減輕慢性炎癥反應(yīng)并保護(hù)線粒體功能[11,28-29]。在RA成纖維樣滑膜細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，抑制表達(dá)水平可以抑制RA成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖并抑制關(guān)節(jié)炎小鼠的炎癥反應(yīng)[30]。主要調(diào)節(jié)線粒體呼吸、乳酸和丙酮酸的產(chǎn)生，并與RA患者的滑膜細(xì)胞增殖和血管生成相關(guān)[11,31]。也能通過影響線粒體功能參與RA的發(fā)展[11]。已被確定為RA的易感基因，可能與帕金森病蛋白7共同調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞并保持其功能完整性；表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致RA成纖維樣滑膜細(xì)胞異常增殖[11]。ROC曲線分析7個(gè)重要基因，AUC值均高于0.5。以上結(jié)果表明這些基因可作為RA的診斷標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。

通過檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫獲得干預(yù)RA銅死亡基因的中藥及其有效成分，得到7種中藥及其41個(gè)有效成分。其中罌粟雖然具有斂肺澀腸、固腎鎮(zhèn)痛等功效，但其主要成分嗎啡和可待因等生物堿具有成癮性，已被國家列入麻醉精神類藥品目錄嚴(yán)格管制[32]。本研究不探討此類藥物及相關(guān)成分。《本草拾遺》和《本草推陳》記載傳統(tǒng)中藥虎杖葉具有平肝潛陽、祛痰熄風(fēng)等功效，臨床上主要應(yīng)用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)疼痛、消炎和消腫等[15]。相關(guān)研究表明，虎杖中有效成分具有抗炎和抗痛風(fēng)作用，在血管生成方面具有雙重作用，且長(zhǎng)期高劑量應(yīng)用虎杖會(huì)產(chǎn)生毒性，造成肝臟損傷，但毒性反應(yīng)具有可逆性[33]。因此，虎杖葉有成為靶向銅死亡緩解RA炎癥癥狀治療藥物的潛在可能，但虎杖葉中發(fā)揮主要治療作用的有效成分尚不明確，需要進(jìn)一步篩選鑒定。根據(jù)RO5成藥原則及毒性預(yù)測(cè)結(jié)果，篩選出咖啡酸、庫明吉啶、大黃素、考邁斯托醇、阿魏酸、沒食子酸和白藜蘆醇7個(gè)藥物成分。分子對(duì)接結(jié)果顯示，這些藥物成分均有與RA銅死亡靶點(diǎn)結(jié)合的可能。白藜蘆醇已被應(yīng)用于臨床治療RA，且治療效果較好。在RA中，白藜蘆醇對(duì)p53通路具有調(diào)控作用并促進(jìn)成纖維樣滑膜細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞凋亡[34]。通過構(gòu)建佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，發(fā)現(xiàn)咖啡酸和阿魏酸可減輕關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥，緩解爪子水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，保護(hù)關(guān)節(jié)組織免受血管翳形成以及軟骨和骨破壞[35-36]。大黃素通過抑制NF-κB通路在膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠中發(fā)揮抗炎作用[37]。沒食子酸可降低促炎細(xì)胞因子水平并誘導(dǎo)成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡[38]。在骨關(guān)節(jié)炎中，考邁斯托醇可以抑制IL-1β誘導(dǎo)的炎癥[39]。由此可見，虎杖葉可以作為靶向銅死亡治療RA的潛在治療藥物。

4 結(jié)論

靶向銅死亡基因促進(jìn)免疫細(xì)胞死亡，從而緩解RA炎癥，是一種很有前景的治療策略。本研究分析了銅死亡基因在RA中表達(dá)水平差異，且可能與記憶CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞和中性粒細(xì)胞免疫浸潤(rùn)相關(guān)。同時(shí)本研究預(yù)測(cè)虎杖葉有效成分可能靶向銅死亡基因緩解RA炎癥。本研究的分析結(jié)果為靶向銅死亡治療RA的相關(guān)研究提供了新的方向和理論基礎(chǔ)，為臨床RA治療提供新的選擇藥物。但研究仍存在一些問題，如未能檢索到草莓車軸草有效成分及其藥理作用的相關(guān)文獻(xiàn)，有待進(jìn)一步深入研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Bioinformatics analysis of targeting cuproptosis-related genes therapy for rheumatoid arthritis and prediction of intervention traditional Chinese medicine

YANG Hui-jun1, GUO Xiang2, LI Wei-qing1, SU Xiao-jun1, TIAN Xue-mei1, WANG Hai-dong1, JIN Fang-mei1

1. Osteopathy and Rheumatology Center, Lanzhou 730050, China 2. The First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, China

To explore the expression of cuproptosis-related genes in rheumatoid arthritis (RA) and mechanism, and to screen the potential traditional Chinese medicine in the treatment RA by targeting cuproptosis-related genes.The RA microarray data were obtained by searching the GEO database, and the expression levels of cuproptosis-related genes in RA were analyzed. The high expression subtypes and low expression subtypes were constructed according to the expression of cuproptosis-related genes, and differential analysis was performed to screen out the cuproptosis-related genes related to RA. Immune infiltration analysis was performed on the gene expression matrix by different groups and the correlation between immune infiltrating cells and cuproptosis-related genes was analyzed. The Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis was performed on differential expressed genes by the Kobas online tool. The Herb database was used to search for potential traditional Chinese medicines and their active ingredients in the treatment of RA by targeting cuproptosis-related gene, and the Autodock vina software was used to simulate the possible binding of drugs and cuproptosis-related target proteins. The expression levels of cuproptosis-related genes in RA were verified by clinical samples.A total of seven cuproptosis-related genes (,,,,,, and) were differentially expressed in RA. The result of immune infiltration analysis showed that activated memory CD4+T cells, resting NK cells, and neutrophils were associated with cuproptosis in RA. The results of pathway enrichment analysis showed that cuproptosis was mainly associated with the chemokine signaling pathway, Toll-like receptor signaling pathway, interleukin-17 (IL-17) signaling pathway, tumor necrosis factor signaling pathway, nuclear factor-κB signaling pathway, p53 signaling pathway, and peroxisome proliferators-activated receptors signaling pathways. Leaf of Huzhang () may be a potential drug in the treatment of RA by targeting cuproptosis-related gene, and the molecular docking results showed that the active components in leaf ofmay bind to cuproptosis-related proteins. The mRNA expression levels of,,andin peripheral blood mononuclear cells of RA patients increased.The expression level of cuproptosis -related genes is related to the progression of RA disease, and predicted thatleaf is a potential drug in treatment of RA by targeting cuproptosis-related genes, which provides a new direction and theoretical basis for the clinical diagnosis and treatment of RA and drug development.

rheumatoid arthritis; cuproptosis-related genes; immune infiltraton; bioinformatics; leaf of; DLD; GLS; FDX1; DLAT

R285

A

0253 – 2670(2023)13 - 4253 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.018

2022-12-23

國家中醫(yī)藥管理局高水平中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目實(shí)施方案（國中醫(yī)藥人教函[2022]226號(hào)）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82260880）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC1705202，2018YFC1705203）；國家中醫(yī)藥管理局行業(yè)專項(xiàng)（20150700107）；甘肅省中醫(yī)藥項(xiàng)目（GZKP-2021-12）；蘭州市科技指導(dǎo)性計(jì)劃項(xiàng)目（2022-ZD-73）；王海東甘肅省名中醫(yī)傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目（甘衛(wèi)中醫(yī)函[2022]50號(hào)）

楊會(huì)軍（1985—），男，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)轱L(fēng)濕骨病發(fā)病機(jī)制及中醫(yī)特色療法和中藥干預(yù)研究。E-mail: yhj_16999@163.com

通信作者：金芳梅，女，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)轱L(fēng)濕骨病發(fā)病機(jī)制及中醫(yī)特色療法和中藥干預(yù)研究。E-mail: 13909406533@163.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]