銀杏二萜內酯葡胺注射液及其銀杏二萜內酯成分抗人臍靜脈內皮細胞氧糖剝奪損傷的轉錄組學研究

徐小波，武子寅，張新莊，曹 亮，王振中，肖 偉,

銀杏二萜內酯葡胺注射液及其銀杏二萜內酯成分抗人臍靜脈內皮細胞氧糖剝奪損傷的轉錄組學研究

徐小波1，武子寅2, 3*，張新莊2, 3，曹 亮2, 3，王振中2, 3，肖 偉1, 2, 3*

1. 南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023 2. 江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇 連云港 222001 3. 中藥制藥過程新技術國家重點實驗室，江蘇 連云港 222001

研究銀杏二萜內酯葡胺注射液（Diterpene Ginkgolides Meglumine Injection，DGMI）及其銀杏二萜內酯成分抗人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells-T1，HUVEC-T1）氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）損傷的潛在作用通路。采用CCK-8法分別測定不同濃度銀杏內酯A（ginkgolide A，GA）、銀杏內酯B（ginkgolide B，GB）、銀杏內酯K（ginkgolide K，GK）和DGMI對HUVEC-T1細胞的毒性，明確藥物處理細胞濃度；采用轉錄組測序技術對溶劑對照組（二甲基亞砜）、模型組（OGD/R 4 h/24 h）及給藥組（造模＋不同劑量DGMI、GA、GB、GK處理）的細胞樣本分別進行轉錄組測序；通過生物信息學分析方法，以GEO數據庫中缺血性腦卒中患者轉錄組數據為參考，采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）、差異基因富集等分析方法完成對HUVEC-T1 OGD模型及不同濃度藥物抗OGD損傷能力的評價，闡明DGMI及其功效成分的潛在作用機制。GSEA分析顯示，臨床缺血性腦卒中患者血液轉錄組數據分析獲得的疾病富集通路與本實驗細胞模型測序結果獲得的富集通路相似度為55.6%；DGMI、GA、GB、GK處理組與模型組相比，顯著富集的主要信號通路包括FcεRI、NOD樣受體、有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等。差異基因分析顯示，與對照組相比，模型組共篩選出439個差異基因，差異基因的基因本體（gene ontology，GO）分析主要富集在應激反應過程，京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析主要富集在磷脂酶D、FcεRI、NOD樣受體和血小板活化等信號通路；與模型組相比，給藥組差異基因的GO分析主要富集在造血和代謝過程，KEGG分析主要富集在血小板活化、磷脂酶D等信號通路。HUVEC-T1 OGD模型模擬了部分缺血性腦卒中的病理特征；DGMI、GA、GB、GK均具有抗OGD損傷作用，發揮抗OGD損傷作用的關鍵基因及信號通路主要集中在抗炎、抗凋亡、調控血小板活化等生物學過程，可能通過下調FcεRI、NOD樣受體、MAPK和VEGF信號通路，干預血小板活化、磷脂酶D等信號通路發揮作用。

銀杏二萜內酯葡胺注射液；銀杏內酯A；銀杏內酯B；銀杏內酯K；人臍靜脈內皮細胞；氧糖剝奪模型；轉錄組測序

腦卒中是世界范圍內導致死亡和殘疾的主要原因之一，每年因腦卒中死亡的人數占全球死亡人數的12%，這一比例在發展中國家更高[1]。隨著人們生活方式的改變與生活水平的提高，腦卒中的發病率呈現上升趨勢[2]，其中血管阻塞導致的缺血性腦卒中約占所有腦卒中類型的85%[3]，引發腦血管阻塞的機制十分復雜，涉及到動脈粥樣硬化、動脈炎癥等，因此其病理機制也十分復雜，缺氧缺糖導致的能量衰竭、谷氨酸等代謝物累積導致的興奮性中毒、炎癥爆發以及神經細胞凋亡等均參與其中。目前臨床上最有效的治療方法是在時間窗內進行重組組織型纖溶酶原激活劑靜脈溶栓或機械取栓，但這2種救治方法時間窗窄、成本高且面臨出血風險[1]，無法滿足目前的臨床需求。因此，開發更可靠的治療藥物和方法至關重要。

銀杏葉提取物制劑是臨床上使用最廣泛的中藥提取物制劑之一，具有拮抗血小板活化因子、擴血管和抗炎等藥理作用[4-6]，被廣泛用于心腦血管疾病治療。銀杏二萜內酯葡胺注射液（Diterpene Ginkgolides Meglumine Injection，DGMI）是主要的銀杏提取物制劑之一[7-8]，其主要活性成分為銀杏內酯A（ginkgolide A，GA）、銀杏內酯B（ginkgolide B，GB）和銀杏內酯K（ginkgolide K，GK）。臨床研究顯示DGMI對中、老年缺血性腦卒中患者均有顯著療效[9-10]。此外，來自不同實驗室的現有研究顯示，GA有抗炎和神經保護等作用[11-12]；GB有抗炎、抗氧化和血小板拮抗等作用[13-14]；GK有抗腦缺血損傷作用[15]。上述研究表明DGMI及其功效成分可能是治療缺血性腦卒中的潛力藥物。為明確DGMI及其功效成分抗腦缺血損傷的潛在作用通路，本研究通過建立人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells-T1，HUVEC-T1）氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）模型，模擬缺血性腦卒中時細胞缺血缺氧的狀態，再利用轉錄組測序技術對對照組、模型組及給藥組的細胞樣本進行轉錄組測序，并結合生信分析方法，鑒定DGMI/GA/ GB/GK抗腦缺血損傷的作用通路及生物學功能，為中藥及中藥功效成分作用機制的科學闡釋提供思路。

1 材料

1.1 細胞

HUVEC-T1細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。

1.2 藥品與試劑

DGMI（國藥準字Z20120024，批號201201）、GA（批號F15IB207297，質量分數為97.4%）、GB（批號S23HB195722，質量分數≥98%）、GK（批號J12HB184945，質量分數≥98%）由江蘇康緣藥業股份有限公司提供；CCK-8試劑盒購自美國Bimake公司；DMEM培養基（批號AE29422782）、雙抗（批號J190015）、胰酶（批號J1900034）購自美國Hyclone公司；胎牛血清（批號11G292）購自依科賽生物；裂解緩沖液（批號20201211-270-1）、裂解酶（批號20201211-270-1）購自博奧生物集團有限公司。

1.3 儀器

Spectra Max Plus 384酶標儀（美國Molecular Devices公司）；T100型PCR儀（美國Bio-Rad公司；4150型TapeStation自動化電泳系統（美國Agilent公司）；Invitrogen Qubit4.0核酸定量儀、Countess II型細胞計數器、3111型CO2細胞培養箱、3131型三氣培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Illumina HiSeq X Ten型測序儀（美國Illumina公司）。

2 方法

2.1 細胞培養

將HUVEC-T1細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的完全培養基，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。實驗前用PBS潤洗，胰酶消化，顯微鏡下觀察，當80%的細胞呈圓形時，加入完全培養基終止消化，轉移至離心管內，800 r/min離心5 min，棄上清，重懸細胞計數，根據實驗需求計算稀釋體積并稀釋。

2.2 CCK-8法測定受試藥細胞毒性

HUVEC-T1細胞以8000個/孔接種至96孔板中，于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后，將細胞分為對照組（加入含對應溶劑的培養基）和給藥組（分別加入含12.5、25、50、100、200 μg/mL DGMI或12.5、25、50、100、200 μmol/L GA、GB、GK的培養基），放入培養箱中繼續培養24 h。取出96孔板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，將96孔板放入培養箱中避光孵育3 h后，移至酶標儀中檢測各組細胞在450 nm處的吸光度（）值。

2.3 轉錄組實驗分組與給藥

HUVEC-T1細胞以1×104個/孔接種至96孔板中，培養24 h。設置對照組、模型組、給藥組，對照組于正常條件下培養；模型組將培養基更換為無糖培養基，置于37 ℃三氣培養箱（94% N2、5% CO2、1% O2）中培養4 h，隨后將培養基換為完全培養基于CO2培養箱中再培養24 h；給藥組相同條件下缺氧培養4 h后分別加入含12.5、25、50、100、200 μg/mL DGMI或12.5、25、50、100、200 μmol/L GA、GB、GK的培養基，于CO2培養箱中培養24 h。加入裂解液，于冰上裂解每個樣本孔5 min。裂解完成后，收集裂解液于?80 ℃冰箱保存備用。

2.4 轉錄組測序

吸取裂解液上清，經反轉錄、PCR擴增和純化后，使用雙端引物進行建庫，質檢合格后混樣pooling，采用Illumina HiSeq X Ten測序平臺進行高通量測序（委托博奧生物集團有限公司完成）。

2.5 轉錄組數據分析

2.5.1 轉錄組數據處理 利用Trimmomatic軟件[16]對測序數據進行過濾，獲取高質量數據信息，再利用HISAT2[17]和StringTie[18]軟件對高質量數據進行序列比對和拼接，統計每組樣本比對到各個基因上的reads數。

2.5.2 體外模型評價 從基因表達綜合數據庫（gene expression omnibus，GEO）中下載3組缺血性腦卒中患者與健康人群血液轉錄組數據（GSE22255、GSE16561、GSE58294）進行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），獲得缺血性腦卒中疾病特征通路集合；將本研究中模型組與對照組的數據對比進行GSEA分析，獲得HUVEC-T1細胞OGD模型的特征通路集合，比較缺血性腦卒中疾病特征通路集合與OGD模型特征通路集合的相似程度，用于判斷本研究構建的OGD模型是否可以表征臨床疾病的特征通路，并用于受試藥物評價。

2.5.3 藥物處理組逆轉通路分析 將上述模型組對照組GSEA分析獲得的通路集定義為OGD特征通路集；將每組藥物處理后的細胞轉錄組數據分別以模型組數據為對照進行GSEA分析，獲取給藥組富集通路，與OGD特征通路集進行比較，并計算藥物干預后表達趨勢逆轉的通路數與OGD特征通路總數的比值（響應值），將該比值作為評價不同受試藥物抗OGD損傷能力的指標：若響應值≥50%，表明該受試藥物具有強抗OGD損傷能力；若響應值為30%～50%，表明該受試藥物有中等抗OGD損傷能力；若響應值＜30%，表明該受試藥物不具備抗OGD損傷能力。

2.5.4 差異基因篩選 采用DESeq[19]軟件包對各組細胞的基因表達量進行差異分析，模型組差異基因以模型組對照組篩選，給藥組差異基因以給藥組模型組篩選（篩選標準|log2(fold change)|≥1.5且≤0.05）。

2.5.5 GO和KEGG富集分析 對各組差異基因進行基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，獲取富集通路，并用R語言將相關信息可視化。

3 結果

3.1 受試藥物的細胞毒性檢測

如圖1所示，受試藥物DGMI在質量濃度不超過200 μg/mL，GA、GB、GK在濃度不超過200 μmol/L時對細胞均無明顯毒性，且DGMI表現出一定的促細胞增殖作用。

3.2 轉錄組測序數據質量分析

在所建立的測序文庫中，36組樣本堿基質量超過20的比例在91.84%以上，超過30的比例在84.42%以上，與指定參考基因組的序列比對率在93.15%以上，表明測序結果較好。

3.3 體外模型評價

如圖2、3所示，與健康人群相比，3組缺血性腦卒中患者數據的富集通路中共有27條通路重合且變化趨勢相同。與對照組相比，模型組共富集到66條通路，其中15條與缺血性腦卒中疾病通路集中的通路重合且變化趨勢相同，包括細胞凋亡、有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、Toll樣受體、NOD樣受體等與炎癥、免疫和凋亡相關的通路。

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

*重合通路，圖3同

圖3 受試藥物干預對OGD損傷后的HUVEC-T1細胞的影響

3.4 藥物干預對GSEA通路的影響

如表2所示，16個不同濃度藥物處理組中，11組表現出中等及以上抗OGD損傷能力（響應值＞30%），其中GB 50 μmol/L（響應值38/66＝57.58%）、GK 50 μmol/L（響應值40/66＝60.61%）、DGMI 25 μg/mL（響應值35/66＝53.03%）均表現出強抗OGD損傷能力，GA 50 μmol/L（響應值32/66＝48.48%）表現出中等抗OGD損傷能力。上述4個組別均逆轉了FcεRI、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、MAPK和NOD樣受體信號通路的表達趨勢，且16個藥物處理組中，FcεRI、VEGF、MAPK和NOD樣受體信號通路的表達趨勢均被8個以上組別逆轉。此外，B細胞受體、T細胞受體、血管平滑肌收縮、自然殺傷細胞介導的細胞毒性等通路均在GA、GB、GK 50 μmol/L通路中被逆轉，DGMI 25 μg/mL中未被逆轉；而轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路則僅在DGMI 25 μg/mL中被逆轉，單體中未被逆轉（圖3）。

表2 藥物干預后各組的響應值

3.5 差異基因分析

如圖4所示，與對照組相比，模型組共篩選獲得439個差異表達基因，其中127個基因上調，312個基因下調；與模型組相比，藥物處理組細胞的差異基因數量見表3，進一步分析發現，部分模型組差異基因在藥物干預后表達趨勢被逆轉（圖5、6）。

圖4 模型組差異基因火山圖

表3 受試藥物干預對OGD處理后的HUVEC-T1細胞基因表達的影響

M-模型組

M-model group

A-模型組上調基因與給藥組下調基因的交集 B-模型組下調基因與給藥組上調基因的交集

圖6 模型組與藥物處理組細胞差異基因熱圖

3.6 受試藥物干預對細胞功能的影響

為明確HUVEC-T1細胞OGD處理以及OGD處理＋不同濃度藥物干預后所涉及的生物學功能變化，本研究對模型組及藥物處理組細胞的差異表達基因進行GO功能富集分析，主要包括生物學過程（GO biological process，GO_BP）、細胞組分（GO cellular component，GO_CC）和分子功能（GO molecular function，GO_MF）富集分析。

3.6.1 差異基因GO_BP富集分析 結果顯示，HUVEC-T1細胞OGD處理后主要富集在機體內凝血功能、血氧運輸、細胞對外界刺激（生物刺激、剪切應力刺激）等生物過程（圖7-a）。藥物干預后，GA組細胞富集在血管生成、碳水化合物代謝等生物過程；GB組細胞富集在生長發育、TORC1信號的調節等生物過程；GK組細胞富集在信號轉導、細胞分化等生物過程；DGMI組富集在鈣離子跨膜轉運、對銨離子的反應等生物過程（圖8）。

3.6.2 差異基因GO_CC富集分析 結果顯示，模型組細胞主要富集在細胞質膜、肌動蛋白細胞骨架與細胞核等組分（圖7-b）。藥物處理后，GA組細胞主要富集在細胞核、細胞質與細胞復合物等組分；GB組細胞主要富集在突觸膜等組分；GK組細胞主要富集在細胞器、突觸膜等組分；DGMI組細胞主要富集在突觸后膜等組分（圖9）。

3.6.3 差異基因GO_MF富集分析 結果顯示，模型組細胞主要富集在GTP酶激活及活性調節等功能（圖7-c）。藥物處理后，GA、GB和GK組細胞均主要富集在蛋白結合、酶活性調節等功能；GK組細胞還在鈣釋放通道活性調節功能富集；DGMI組細胞則主要在酶活性調節功能富集（圖10）。

a-GO_BP分析 b-GO_CC分析 c-GO_MF分析

圖8 給藥組差異基因GO_BP富集分析

圖9 給藥組差異基因GO_CC通路富集分析

圖10 給藥組差異基因GO_MF通路富集分析

3.7 差異基因KEGG通路富集分析

為明確DGMI及其功效成分影響OGD處理后HUVEC-T1細胞的功能和狀態的KEGG作用通路，本研究對獲得的差異基因進行KEGG通路富集分析。結果顯示，模型組差異基因富集于13條KEGG疾病通路，主要涉及炎癥、凋亡和免疫反應。與模型組相比，16個藥物處理組中有4組在13條KEGG疾病通路上富集（圖11），主要包括血管平滑肌收縮、血小板活化、自然殺傷細胞介導的細胞毒性和磷脂酶D信號通路。

中藥制劑及活性成分具有多靶點特性，可能涉及對其他通路的影響，本研究進一步對給藥組差異基因進行KEGG分析，篩選在藥物處理組中顯著富集且屬于心血管疾病、細胞生長與死亡、發育與再生、免疫系統、脂質代謝、神經系統、信號轉導7類二級通路中的KEGG通路。結果顯示，不同濃度藥物處理后，細胞還在神經發育、能量供應、血管再生和神經保護相關通路顯著富集（圖12）。

圖11 差異基因KEGG富集分析

圖12 藥物處理組差異基因在7類KEGG通路中的富集情況

4 討論

近年來，大量的研究證實部分銀杏葉提取物制劑對缺血性腦卒中后腦損傷具有改善作用，如金納多[20-22]、DGMI[9,23-24]等。DGMI作為主要的銀杏葉提取物制劑之一[8]，已有較多抗腦缺血相關的研究，但這些研究大多以動物為載體且主要針對特定通路或靶標，具有研究偏好，忽略了對潛在作用通路的探索；此外，在動物體內開展中藥提取物制劑作用機制研究存在動物個體差異大，研究成本高，實驗周期長等缺陷。因此，開發針對多個通路、低成本、可重復性強且普遍適用的研究策略對于開展中藥及中藥功效成分的作用機制研究具有重要意義。轉錄組學能全面地反映細胞內的基因表達情況，通過比較細胞內基因表達情況可以明確對照組、模型組以及藥物處理組細胞的差異，更全面地研究藥物作用機制及通路。

本研究基于二代測序技術的高通量轉錄組測序策略，在體外OGD誘導的HUVEC-T1細胞模型上評價中藥提取物注射液DGMI及其功效成分的抗OGD損傷能力及潛在作用通路。通過對GEO數據庫中缺血性腦卒中患者與正常人群轉錄組數據及模型組與對照組細胞轉錄組數據進行GSEA分析并比較，明確了OGD處理后的HUVEC-T1細胞具有部分缺血性腦卒中的病理特征，提示本研究選用的體外細胞模型是模擬缺血性腦卒中的合理模型。

進一步GSEA分析發現，經DGMI、GA、GB、GK干預后，模型組細胞中的OGD特征通路表達趨勢被不同程度逆轉，提示DGMI及GA/GB/GK均具備一定的抗OGD損傷活性。缺血性腦卒中患者及本研究模型組細胞的GSEA通路中，NOD樣受體、MAPK、FcεRI、VEGF通路均為上調趨勢，在DGMI、GA、GB、GK干預后，NOD樣受體、MAPK、FcεRI、VEGF通路均變為下調趨勢。過往的研究證實，卒中發生后，由于腦內ATP供應減少，胞內K+外流、Ca2+內流，NOD樣受體炎性小體被激活，進而激活MAPK和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路，誘導NOD樣受體家族中炎性小體相關蛋白的轉錄翻譯，導致促炎細胞因子釋放增加，炎癥加劇，最終誘導細胞凋亡，導致大腦損傷[25-27]。也有研究證明FcεRI受體可與IgE分子結合激活肥大細胞釋放促炎細胞因子，加劇炎癥[27-28]。VEGF對缺血性腦卒中恢復具有重要作用，但在缺血性腦卒中急性期，急劇增加的VEGF可能會導致血腦屏障和血管破壞[29]。在系列針對臨床缺血性腦卒中患者的轉錄組研究中，有研究者也認為NOD樣受體、MAPK和FcεRI信號通路是缺血性腦卒中患者診斷與治療的關鍵通路[30-31]。提示DGMI、GA、GB、GK均具有抗OGD損傷作用，其作用機制可能為誘導下調NOD樣受體、MAPK、FcεRI和VEGF信號通路，發揮減輕炎癥、抑制細胞凋亡和保護血腦屏障等作用，進而減輕腦缺血損傷。GSEA分析還發現與DGMI相比，GA、GB、GK單體對免疫相關通路的調節作用更為顯著，如調節T細胞受體、B細胞受體等；而DGMI則還對促進血管生成、抑制氧化應激、代謝等通路調節能力更強，如TGF-β信號通路等。

此外，差異基因分析結果顯示，與對照組相比，模型組細胞篩選獲得439個差異表達基因，其中127個基因上調，312個基因下調；DGMI、GA、GB、GK干預后，可逆轉31個差異基因，包括前列腺素內過氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、基質金屬肽酶14（matrix metallopeptidase 14，MMP14）、胰島素樣生長因子結合蛋白2（insulin like growth factor binding protein 2，IGFBP2）等。在針對臨床缺血性腦卒中患者的研究中，PTGS2、MMP14被認為是與缺血性腦卒中相關的關鍵基因、是潛在的診斷生物標志物，被推薦為缺血性腦卒中的治療靶點[32-34]，IGFBP2被認為是治療缺血性腦卒中的新型生物標志物[35-37]。提示DGMI、GA、GB、GK可能通過調控MMP14、PTGS2、IGFBP2等多個基因參與缺血性腦卒中后的大腦修復過程。

DGMI、GA、GB、GK干預可以改變OGD處理后HUVEC-T1細胞內的主要生物學過程，由血氧運輸和應對外界刺激反應轉變為血管生成、生長發育與代謝調節等。在差異基因KEGG分析中，模型組共富集到13條通路，其中磷脂酶D信號通路與腦缺血密切相關，磷脂酶D活性增加會促進腦缺血的發生，加劇大腦損傷[38-39]；T細胞受體、B細胞受體信號通路與細胞內免疫反應相關[40]；FcεRI、NOD樣受體信號通路與炎癥和凋亡相關[41]。在系列針對臨床缺血性腦卒中患者與健康人群轉錄組數據的差異基因KEGG富集分析中，FcεRI、NOD樣受體、T細胞受體、B細胞受體等信號通路也被顯著富集[30-31]。經DGMI、GA、GB、GK干預后，DGMI組細胞差異基因在血管平滑肌收縮和磷脂酶D信號通路富集；GB組細胞差異基因在血管平滑肌收縮、血小板活化、自然殺傷細胞介導的細胞毒性通路富集。提示DGMI可能通過干預血管平滑肌收縮和磷脂酶D信號通路；GB可能通過干預血管平滑肌收縮、血小板活化和自然殺傷細胞介導的細胞毒性發揮抗OGD損傷作用。此外，對藥物處理組KEGG分析結果進一步分析發現GA組細胞還在mTOR等信號通路富集；GK組細胞還在MAPK等信號通路富集；DGMI組細胞還在Hedgehog等信號通路富集。盡管這3條通路未在模型組差異基因KEGG分析中被富集，但在模型組GSEA分析中，該3條通路均被富集到。有研究表明mTOR信號通路可維持細胞基本功能，促進軸突再生和神經功能恢復，促進缺氧誘導因子1合成以增加能量供應，維持線粒體功能，改善大腦損傷[42-44]。也有研究顯示Hedgehog信號通路參與誘導缺血后新生血管的生成[45]，其中音猬因子（Shh）可以控制部分促進新生血管形成和血管成熟的生長因子表達[46]，指導血管形成和成熟[47]。提示這部分通路可能也是DGMI、GA、GB、GK抗OGD損傷的潛在作用通路。

本研究采用2類分析方法，即基于全部基因的GSEA分析方法和基于差異基因的GO和KEGG分析方法。在本研究中，與差異基因GO和KEGG分析結果相比，GSEA分析得出的結果與臨床缺血性腦卒中患者轉錄組分析結果更吻合。一般而言，中藥提取物制劑及中藥活性成分作用機制比較復雜，且具有弱結合、多靶點的特性，能同時影響多個基因的表達[48]，差異基因相關分析僅關注差異最顯著的部分基因，可能無法完全展示中藥制劑或中藥活性成分潛在的作用機制及通路。與差異基因分析方法相比，GSEA分析方法可能更適用于中藥制劑及中藥活性成分的作用機制研究。

綜上，本研究應用轉錄組學研究方法對DGMI及其功效成分抗OGD損傷的作用機制及通路進行探索，首先通過對缺血性腦卒中患者與本研究中模型組細胞數據進行分析對比，證實HUVEC-T1 OGD模型能夠模擬部分缺血性腦卒中的病理特征。然后對本研究中的細胞轉錄組數據進行GSEA、差異基因GO和KEGG分析，明確了DGMI及其功效成分具有抗OGD損傷能力以及發揮抗OGD損傷作用的主要作用機制及通路，即通過下調FcεRI、NOD樣受體、MAPK和VEGF信號通路發揮減輕炎癥、抑制細胞凋亡和保護血腦屏障作用；通過影響磷脂酶D、血小板活化等信號通路發揮抗OGD損傷作用。此外，本研究還發現了部分DGMI及其功效成分抗OGD損傷的潛在作用通路。本研究為后續深入挖掘DGMI及其功效成分治療缺血性腦卒中的分子機制和靶點提供了研究思路及參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Transcriptome study of Diterpene Ginkgolides Meglumine Injection and its components against oxygen-glucose deprivation damage in HUVEC-T1 cells

XU Xiao-bo1, WU Zi-yin2, 3, ZHANG Xin-zhuang2, 3, CAO Liang2, 3, WANG Zhen-zhong2, 3, XIAO Wei1, 2, 3

1. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China 3. State Key Laboratory of New Technology for Pharmaceutical Process of Traditional Chinese Medicine, Lianyungang 222001, China

To study the potential pathway of Diterpene Ginkgolides Meglumine Injection (銀杏二萜內酯葡胺注射液, DGMI) and its ginkgo diterpene lactone components against oxygen-glucose deprivation (OGD) injury in human umbilical vein endothelial cells-T1 (HUVEC-T1).CCK-8 method was used to determine the toxicity of ginkgolide A (GA), ginkgolide B (GB), ginkgolide K (GK) and DGMI at different concentrations on HUVEC-T1 cells, and determine the drug treatment cell concentration. Transcriptomic sequencing was performed on the cell samples of solvent control group (DMSO), model group (OGD/R 4 h/24 h) and the drug administration group (modeling + different doses of GA, GB, GK, DGMI treatment), respectively. Through bioinformatics analysis, the transcriptomic data of ischemic stroke patients in GEO database was used as reference, gene set enrichment analysis (GSEA) and differential genes enrichment analysis methods were used to evaluate the HUVEC-T1 OGD model and the anti-OGD ability of different concentrations of drugs, and to clarify the potential mechanism of action of DGMI and its functional components.GSEA analysis showed that the similarity between the disease enrichment pathway obtained from the analysis of blood transcriptome data of clinical ischemic stroke patients and the enrichment pathway obtained from the cell model sequencing results in this experiment was 55.6%. Compared with model group, the main signaling pathways in DGMI, GA, GB, GK treatment group were significantly enriched, including FcεRI, NOD like receptors, mitogen-activated protein kinase (MAPK), vascular endothelial growth factor (VEGF), etc. Differential genes analysis showed that 439 differential genes were detected in model group compared with control group. Gene ontology (GO) analysis of differential genes was mainly enriched in the stress response process, while Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) analysis was mainly enriched in phospholipase D, FcεRI, Nod-like receptor and platelet activation signaling pathways. Compared with model group, GO analysis of differential genes in administration group was mainly enriched in hematopoietic and metabolic processes, while KEGG analysis was mainly enriched in signal pathways such as platelet activation and phospholipase D, etc.The HUVEC-T1OGD model simulated the pathological features of partial ischemic stroke. DGMI, GA, GB, GK have anti-OGD damage effects. The key genes and signaling pathways of DGMI, GA, GB, GK in anti-OGD injury mainly focus on anti-inflammatory, anti-apoptosis, regulation of platelet activation and other biological processes, which may down-regulate FcεRI, Nod-like receptor, MAPK and VEGF signaling pathways, and intervene in platelet activation and phospholipase D and other signaling pathways.

Diterpene Ginkgolides Meglumine Injection; ginkgolide A;ginkgolide B; ginkgolide K; human umbilical vein endothelial cells; oxygen-glucose deprivation model; transcriptomic sequencing

R285.5

A

0253 - 2670(2023)13 - 4233 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.016

2022-11-25

江蘇省自然科學青年基金資助項目（BK20210139）

徐小波，男，碩士研究生，研究方向為中藥新藥的研究與開發。E-mail: 1165992664@qq.com

通信作者：肖 偉，中國工程院院士，研究員，博士生導師，研究方向為中藥新藥的研究與開發。E-mail: kanionlunwen@163.com

武子寅，博士，研究方向為中藥新藥研發。E-mail: cs416@qq.com

[責任編輯 李亞楠]