miR-20a通過ATG16L1影響細胞自噬并參與調節雷公藤甲素肝毒性

張彩霞，王偉艷，李會芳，杜晨暉，劉 珊，魏硯明

miR-20a通過ATG16L1影響細胞自噬并參與調節雷公藤甲素肝毒性

張彩霞，王偉艷，李會芳，杜晨暉，劉 珊，魏硯明*[1]

山西中醫藥大學中藥與食品工程學院，山西 晉中 030619

觀察雷公藤甲素對miR-20a及自噬相關16樣蛋白L1（autophagy related 16 like protein1，ATG16L1）表達的影響，探討miR-20a對雷公藤甲素所致肝細胞毒性的調控作用。利用雷公藤甲素處理人正常肝細胞株HL7702和C57BL/6J小鼠，通過qRT-PCR和Western blotting檢測、ATG16L1及自噬標記物微管相關蛋白1輕鏈3II（microtubule-associated protein 1 light 3II，LC3II）的表達。利用雷公藤甲素和miR-20a模擬物或抑制物共同處理HL7702細胞，通過qRT-PCR和Western blotting檢測ATG16L1及LC3II的表達；CCK-8法檢測細胞存活率；試劑盒檢測乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）釋放量；ELISA檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）和Caspase-9的活性。雷公藤甲素顯著下調人正常肝細胞或小鼠肝組織中表達（＜0.05），上調ATG16L1和LC3II的表達（＜0.05）。miR-20a模擬物可抑制雷公藤甲素引起的ATG16L1、LC3II表達升高（＜0.05），進一步降低細胞存活率（＜0.05），提高LDH釋放量（＜0.05），上調Caspase-3和Caspase-9活性（＜0.05），而miR-20a抑制物具有相反作用。miR-20a通過ATG16L1影響自噬過程，參與調節雷公藤甲素肝細胞毒性。

雷公藤甲素；肝細胞毒性；細胞自噬；miR-20a；ATG16L1；細胞凋亡

中藥引起的肝損傷是臨床上藥物肝損傷的重要病因之一。雷公藤甲素既是傳統中藥雷公藤Hook. f.的主要活性成分，具有免疫調節、神經保護、抗血管生成、抑制細胞增殖及促細胞凋亡等藥理活性，也是引起肝臟毒性不良反應的主要物質基礎[1-2]。研究表明有多種機制參與雷公藤甲素所致肝毒性，如藥物代謝與轉運紊亂、氧化應激、細胞凋亡、免疫損傷、腸道菌群失調等[3]。此外，細胞自噬也被認為是雷公藤甲素引起肝毒性的關鍵機制[4]。細胞自噬是一種進化高度保守并受嚴格調控的將底物運送至溶酶體中降解的過程。雷公藤甲素可劑量相關性激活肝癌細胞自噬活性，促進肝癌細胞死亡[5-6]。在正常肝細胞系中，雷公藤甲素通過促進自噬關鍵蛋白Beclin1的表達上調細胞自噬活性[7]。另外，雷公藤甲素處理可導致斑馬魚肝組織中自噬相關基因和自噬相關基因5（autophagy-related gene 5，）表達明顯升高[8]，引起小鼠肝組織中自噬標記物微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light 3，LC3）堆積[9]。因此，調節細胞自噬水平可能為抑制或減輕其肝毒性的潛在途徑。然而，目前對于雷公藤甲素調節肝細胞自噬的作用途徑及細胞自噬在雷公藤甲素肝毒性中的功能仍有待闡明。

小RNAs（miRNAs/miRs）是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。通過與特定mRNA的3’-UTR結合，引起mRNA降解或抑制蛋白質翻譯。miRNAs參與調控細胞分化、器官發育、細胞代謝、細胞凋亡等多種生理過程，其表達異常與多種疾病的發生密切相關，是潛在的疾病診斷生物標志物和藥物的治療靶點[10]。雷公藤甲素可以上調或下調多種miRNAs的表達，影響多條信號通路，實現其抗腫瘤、抗炎、免疫調節及抗血管生成等多種藥理活性[11]。另外，miRNAs通過調控細胞自噬相關基因或調節因子的表達，在細胞自噬過程中發揮關鍵作用[12]。

本課題組利用轉錄組測序觀察到雷公藤甲素能明顯下調正常肝細胞中miR-20a表達，并且Targetscan（http://www.targetscan.org/vert.72/）、miRDB（http://mirdb.org）網站預測ATG16L1為其下游靶點。由于ATG16L1是自噬小體形成所必需的關鍵蛋白質[13]，推測miR-20a可能作為雷公藤甲素的作用靶點，參與調控細胞自噬，并在雷公藤甲素肝毒性中發揮作用。本實驗擬觀察雷公藤甲素對正常肝細胞中miR-20a及其下游潛在靶點ATG16L1表達的影響，探討miR-20a對雷公藤甲素所致肝細胞毒性的調控作用，旨在為增進對雷公藤甲素肝毒性作用機制的了解，尋找雷公藤甲素肝毒性的生物標志物提供線索。

1 材料

1.1 細胞及動物

人正常肝細胞株HL-7702購自北納創聯生物技術有限公司。

SPF級雄性C57BL/6J小鼠，體質量16～18 g，6周齡，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2019-0010。動物實驗經山西中醫藥大學動物倫理委員會批準（倫理批準號2021DW207）。

1.2 藥品與試劑

雷公藤甲素（質量分數＞98%，批號210607）購自上海融禾醫藥科技發展有限公司；氯喹（批號C6628）購自美國Sigma公司；Lipofectamine 2000轉染試劑（批號2307486）購自美國Thermo公司；BCA蛋白濃度試劑盒（批號20211101）購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白酶抑制劑（P1006）、RIPA蛋白裂解液（批號011921210824）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體（批號AA128）購自上海碧云天生物技術有限公司；RPMI 1640完全培養基、Opti-MEM培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司；超敏ECL化學發光試劑盒（批號MA0186-1-Nov-16G）購自大連美倫生物技術有限公司；CCK-8試劑盒（批號JH620）購自日本同仁化學科技（上海）有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（批號20220319）、谷草轉氨酶（glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT）試劑盒（批號C010-2-1），谷丙轉氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）試劑盒（批號C009-2-1）購自南京建成生物工程研究所；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）、Caspase-9試劑盒（批號20211215）購自上海瓦蘭生物科技有限公司；ATG16L1 3’-UTR野生型（Wt）和突變型（Mut）熒光質粒，由分別向pmirGLO熒光素酶載體XhoI/XbaI位點插入含有miR-20a預測靶序列（GCACTTT）及突變靶序列（TTGACCC）3’-UTR片段得到，由上海吉瑪基因有限公司提供；pCMV-FLAG-ATG16L1質粒，向pCMV-Flag載體EcoRI/XhoI位點插入ATG16L1 cDNA序列得到，由PPL生物有限公司提供；pEGFP-N1-LC3質粒受贈于山西中醫藥大學任晉宏博士；LC3II抗體（批號GR3338049-2）購自英國Abcam公司；ATG16L1抗體（批號H226AA0020）、Trizol試劑（批號G921KA7073）、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒（批號HCT4KA2901）、miRNA熒光定量PCR試劑盒（批號H712KA0769）、MightyScript第一鏈cDNA合成Master Mix（批號H525KA0190）、SGExcel FastSYBR qPCR預混液（批號I112KA3257）、miR-20a模擬物（mimics）、miR-20模擬物陰性對照（mimics NC）、miR-20a抑制物（inhibitor）、miR-20抑制物陰性對照（inhibitor NC）均由上海生工生物工程有限公司提供；實驗中所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

1.3 儀器

Galaxy 170s CO2培養箱（德國Eppendorf公司）；Allegra X-30R型臺式冷凍離心機（美國Beckman Coulter公司）；EasyWeLL系列JY98-IIIN型細胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；倒置激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）；微量紫外分光光度計（美國Thermo公司）；Power Wave全波長酶標儀（美國Bio-Tek公司）；Powercycler普通PCR儀（英國Analylik Jena公司）；FQD-96A型多功能實時熒光定量PCR擴增儀（杭州博日公司）；ImageQuant LAS 500化學發光成像系統（美國GE公司）。

2 方法

2.1 細胞培養

HL7702細胞用含10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI 1640完全培養基中，置于5% CO2、95%空氣的37 ℃恒溫培養箱中培養。

2.2 細胞及動物分組和給藥

取對數生長期的HL7702細胞，加入25、50、100 nmol/L雷公藤甲素處理24 h或用50 nmol/L雷公藤甲素處理12、24、48 h后，檢測細胞存活率，并檢測和ATG16L1表達；根據Lipofectamine 2000轉染試劑說明，將HL7702細胞轉染pEGFP-N1-LC3質粒24 h后，加入25、50、100 nmol/L雷公藤甲素處理24 h，檢測LC3點狀物的形成；設置對照組（僅加入培養基）、miR-20a mimics組、miR-20a mimics NC組，轉染24 h后，檢測miR-20a和ATG16L1表達；將miR-20a mimics、miR-20a mimics NC與ATG16L1 3’-UTR Wt、ATG16L1 3’-UTR Mut熒光質粒分別共轉染到HL7702細胞內，檢測熒光強度；設置對照組（僅加入培養基）、雷公藤甲素組、雷公藤甲素＋miR-20a mimics組、雷公藤甲素＋miR-20a mimics NC組、雷公藤甲素＋miR-20a inhibitor組、雷公藤甲素＋miR-20a inhibitor NC組、雷公藤甲素＋miR-20a mimics＋ATG16L1組、雷公藤甲素＋氯喹（20 μmol/L）組，轉染miR-20a mimics、miR-20a inhibitor和50 nmol/L雷公藤甲素共同處理48 h，或轉染miR-20a mimics和50 nmol/L雷公藤甲素共同處理24 h后，轉染pCMV-FLAG-ATG16L1，繼續培養24 h后，檢測細胞存活率、LDH釋放量，并檢測Caspase-3、Caspase-9活性和ATG16L1、LC3II蛋白表達。

將C57BL/6J小鼠隨機分為對照組、雷公藤甲素組，每組6只，對照組ip 0.9%生理鹽水，雷公藤甲素ip 0.8 mg/kg雷公藤甲素，每2天注射1次，注射3次，末次給藥24 h后，分離血清，取肝組織，備用。

2.3 CCK-8法檢測細胞存活率

將HL7702細胞接種到96孔板中，經不同處理后，按照CCK8試劑盒說明書測得各孔吸光度（）值并計算細胞存活率。

2.4 RNA提取及qRT-PCR檢測

按照Trizol試劑說明書提取不同處理細胞和小鼠肝組織中的總RNA，分別使用miRNA第一鏈cDNA試劑盒和MightyScript第一鏈cDNA合成Master Mix進行反轉錄，隨后以反轉錄產物為模板，以為內參，以為內參，通過miRNA熒光定量PCR試劑盒和SGExcel FastSYBR qPCR預混液分別對和進行定量分析。

2.5 蛋白提取及Western blotting檢測

細胞經PBS漂洗后，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解15 min后，23號針頭反復吹打破碎細胞，或取適量小鼠肝組織，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，組織勻漿儀破碎后，4 ℃、3500 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。將上清液與5×SDS上樣緩沖液混勻，95 ℃加熱5 min使蛋白變性。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入含5%脫脂奶粉的TBST，室溫封閉1 h，加入ATG16L1、LC3II一抗（1∶1000），4 ℃孵育過夜后，加入二抗（1∶5000），室溫孵育1 h。采用ECL化學發光試劑盒在化學發光成像系統下進行曝光，Image J軟件定量目的條帶。

2.6 激光共聚焦顯微鏡觀察LC3點狀物

將轉染pEGFP-N1-LC3質粒的HL7702細胞經4%多聚甲醛固定后，DAPI溶液染細胞核，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察LC3點狀物的形成。隨機選取5個視野不少于150個細胞，對其中含有≥5個LC3點狀物的細胞進行計數。

2.7 雙熒光素酶報告基因實驗

將miR-20a mimics、miR-20a mimics NC分別和ATG16L1 3’-UTR Wt和Mut熒光質粒共轉染至HL7702細胞48 h后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書測定熒光強度。

2.8 LDH釋放量檢測

HL7702細胞經不同處理后，收集細胞培養液，2500 r/min離心10 min，取上清液，根據LDH檢測試劑盒說明書測定LDH釋放量。

2.9 Caspase-3和Caspase-9活性檢測

細胞經胰酶消化后，2500 r/min離心5 min，收集細胞，加入預冷PBS，利用細胞破碎儀進行破碎，4 ℃、3000 r/min離心5 min，按照ELISA試劑盒說明書測定Caspase-3和Caspase-9活性。

2.10 GOT和GPT活性檢測

按照GOT和GPT試劑盒說明書檢測小鼠血清中GOT和GPT活性。

2.11 統計學分析

3 結果

3.1 雷公藤甲素降低HL7702細胞存活率

HL7702細胞經不同濃度的雷公藤甲素處理24 h后，CCK-8法檢測細胞存活率，結果顯示雷公藤甲素可以顯著抑制細胞活力（＜0.05），且呈劑量相關性（圖1-A）。為了比較雷公藤甲素不同處理時間對細胞存活率的影響，HL7702細胞經50 nmol/L雷公藤甲素處理12、24、48 h后，檢測HL7702細胞存活率，結果顯示隨著處理時間延長，細胞存活率逐漸降低（＜0.05，圖1-B）。

3.2 雷公藤甲素對HL7702細胞miR-20a和ATG16L1表達的影響

HL7702細胞經不同濃度的雷公藤甲素處理24 h后，利用qRT-PCR和Western blotting檢測和ATG16L1的表達，結果顯示25 nmol/L雷公藤甲素處理的HL7702細胞中未觀察到和ATG16L1的表達有明顯變化（圖2-A），但隨著雷公藤甲素濃度的提高，的表達顯著降低（＜0.05），ATG16L1的表達顯著提高（＜0.05）。為了比較雷公藤甲素不同處理時間對和ATG16L1的表達，將HL7702細胞經50 nmol/L雷公藤甲素處理12、24、48 h后，檢測和ATG16L1的表達，結果顯示不同處理時間均引起表達顯著降低（＜0.05，圖2-B）；而在經雷公藤甲素處理12 h的HL7702細胞中未觀察到mRNA和蛋白的表達有明顯變化，但雷公藤甲素處理24、48 h顯著提高mRNA和蛋白的表達（＜0.05）。

與對照組或0 h比較：*P＜0.05，圖2、4、5同

圖2 不同濃度 (A)或處理時間(B) 的雷公藤甲素對HL7702細胞miR-20a和ATG16L1表達的影響(, n = 3)

3.3 miR-20a靶向調節ATG16L1的表達

雙熒光素酶報告基因檢測（圖3-A）結果顯示，ATG16L1 3’-UTR Wt熒光質粒與miR-20a mimics共轉染組相對熒光強度顯著低于miR-20a mimics NC（＜0.05），而Mut熒光質粒共轉染組無明顯變化。HL7702細胞轉染miR-20a mimics后，ATG16L1的mRNA和蛋白表達均顯著降低（＜0.05），而miR-20a mimics NC對ATG16L1表達量則無明顯影響（圖3-B）。以上結果說明，miR-20a能夠靶向結合于ATG16L1的3’-UTR，進而抑制mRNA轉錄后水平。

與ATG16L1 Wt＋mimics NC組比較：*P＜0.05；與對照組比較：#P＜0.05

3.4 雷公藤甲素對HL7702細胞自噬的影響

LC3II作為細胞自噬的底物，特異定位于自噬小體膜上，其表達量與自噬小體數量正相關。因此，LC3II常作為檢測自噬水平的標志物[14-15]。HL7702細胞經不同濃度的雷公藤甲素處理24 h后，Western blotting檢測LC3II的表達，結果顯示50、100 nmol/L的雷公藤甲素顯著提高LC3II表達（＜0.05，圖4-A）。利用不同濃度的雷公藤甲素處理轉染pEGFP-N1-LC3質粒的HL7702細胞24 h，觀察到雷公藤甲素可劑量相關性增加自噬小體點狀物的形成（＜0.05，圖4-B）。

自噬流是由吞噬泡組裝位點的形成、自噬小體的形成、自噬小體與溶酶體的融合及底物的降解等多個連續步驟組成的動態過程。自噬流活化引起的自噬小體形成增多或受阻引起的自噬小體降解抑制均能導致LC3II表達升高[16]。當使用自噬抑制劑氯喹阻斷自噬小體與溶酶體的融合時，如果雷公藤甲素能夠激活細胞自噬流，氯喹處理則進一步增加LC3II表達，反之，氯喹處理對LC3II表達無明顯影響[17]。為了觀察雷公藤甲素對肝細胞中自噬流的影響，HL7702細胞經50 nmol/L雷公藤甲素單獨處理或和20 μmol/L氯喹共同處理24 h后，Western blotting檢測LC3II的表達，結果顯示，雷公藤甲素與氯喹共處理較雷公藤甲素單獨處理LC3II表達進一步提高（＜0.05，圖4-C），表明雷公藤甲素可促進細胞自噬流。

與雷公藤甲素組比較：#＜0.05

#< 0.05triptolide group

3.5 雷公藤甲素對小鼠血清中GOT、GPT活性及肝組織中miR-20a、ATG16L1與LC3II表達的影響

利用試劑盒檢測小鼠血清中GOT和GPT的活性，結果顯示與對照組比較，雷公藤甲素組小鼠血清中GOT和GPT活性顯著升高（＜0.05，圖5-A），表明肝毒性模型構建成功。通過qRT-PCR和Western blotting檢測小鼠肝組織中、ATG16L1和LC3II的表達水平，結果顯示雷公藤甲素組顯著下調，mRNA和蛋白表達顯著上調（＜0.05），LC3II蛋白表達升高（＜0.05，圖5-B、C）。

3.6 miR-20a對雷公藤甲素引起HL7702細胞自噬活化的影響

HL7702細胞經50 nmol/L雷公藤甲素單獨處理或轉染miR-20a mimics、miR-20a inhibitor共同處理24 h后，qRT-PCR和Western blotting檢測mRNA和LC3II的表達，結果顯示，miR-20a mimics顯著抑制雷公藤甲素引起的mRNA和LC3II表達升高（＜0.05），miR-20a inhibitor可進一步促進mRNA和LC3II表達上調（＜0.05），而miR-20a mimics NC或inhibitor NC則無明顯影響（圖6）。

圖5 雷公藤甲素對C57BL/6J小鼠肝功能指標(A)、肝組織miR-20a及ATG16L1 mRNA表達(B) 和ATG16L1及LC3II蛋白表達(C) 的影響(, n = 3)

與雷公藤甲素組比較：*P＜0.05

3.7 miR-20a對雷公藤甲素引起HL7702細胞毒性的影響

LDH是細胞內糖酵解途徑中的氧化還原酶，其釋放量反映細胞膜的完整性，是細胞毒性的重要指標[18]；細胞凋亡是雷公藤甲素引起肝毒性的重要機制，其中Caspase-3和Caspase-9級聯活化反應是凋亡過程中的關鍵信號通路[8]。HL7702細胞經50 nmol/L雷公藤甲素單獨處理或與轉染miR-20a mimics、miR-20a inhibitor、FLAG-ATG16L1及20 μmol/L氯喹共同處理后，檢測細胞存活率、LDH釋放量、Caspase-3和Caspase-9活性。如圖7所示，與對照組比較，雷公藤甲素顯著降低細胞存活率（＜0.05），提高LDH釋放量（＜0.05），上調Caspase-3和Caspase-9活性（＜0.05）。轉染miR-20a mimics和雷公藤甲素共處理較雷公藤甲素單獨處理細胞存活率進一步下降（＜0.05），LDH釋放量進一步增多（＜0.05），Caspase-3和Caspase-9活性顯著提高（＜0.05），陰性對照miR-20a mimics NC則無明顯影響；與轉染miR-20a mimics比較，轉染miR-20a inhibitor對細胞存活率、LDH釋放量、Caspase-3和Caspase-9活性具有相反效應（＜0.05）。利用氯喹抑制自噬小體和溶酶體的融合[19]，干預細胞自噬過程可進一步加劇雷公藤甲素肝細胞毒性（＜0.05）。而共轉染FLAG-ATG16L1則逆轉miR-20a mimics對雷公藤甲素對HL7702細胞存活率、LDH釋放量、以及Caspase-3和Caspase-9活性的影響（＜0.05）。

與雷公藤甲素組比較：*P＜0.05；與雷公藤甲素＋miR-20a mimics組比較：#P＜0.05

4 討論

多種miRNAs在雷公藤甲素的藥理作用中發揮關鍵作用[11]。雷公藤甲素通過下調miR-155表達，引起SHIP1表達升高，從而抑制α-突觸核蛋白引起的炎癥因子釋放和小膠質細胞活化[20]。雷公藤甲素可抑制高糖誘導的人腎小管上皮細胞中miR-188表達上調，阻斷PTEN信號通路，逆轉糖尿病腎病上皮間質細胞轉化[21]。另外，miRNAs與細胞自噬的起始、延伸及成熟等多個階段密切相關[22]。miR-376b可下調自噬關鍵基因和的表達，抑制自噬起始[23]。miR-181a和miR-630分別調節、表達，影響細胞自噬囊泡伸展階段[24]。miR-130則可通過靶向自噬小體-溶酶體融合關鍵基因人溶酶體關聯膜蛋白1（lysosomal associated membrane protein 1，），參與調節融合過程[25]。作為miR-17-92簇的一員，miR-20a通過阻斷自噬相關基因和的表達，抑制缺氧引起的結腸癌細胞自噬活化[26]。miR-20a也可負調控ATG7表達，阻斷細胞自噬，從而抑制神經母細胞瘤細胞增殖[27]。另外，mRNA也被證明為miR-20a的下游靶點。ATG16L1能夠與自噬起始過程中泛素樣結合系統中的ATG12-ATG5復合體非共價結合，在隔離膜的延伸及自噬小體雙層膜的形成過程中發揮關鍵作用[28]。miR-20a通過下調ATG16L1的表達抑制細胞自噬，從而促進巨噬細胞中分枝桿菌的存活[29]。缺氧引起的miR-20a表達抑制能夠上調ATG16L1表達并誘導自噬活化，引起破骨細胞分化[30]。本研究中，雷公藤甲素在引起肝細胞毒性、誘導肝細胞自噬活化的同時，能夠明顯降低正常肝細胞和肝組織中miR-20a的表達，上調ATG16L1的表達。雙熒光素酶報告實驗證實miR-20a結合于ATG16L1的3’-UTR，并且miR-20a mimics或inhibitor能夠阻斷或進一步促進雷公藤甲素引起的肝細胞中ATG16L1及自噬標記物LC3II表達升高。因此，雷公藤甲素通過靶向調節miR-20a的表達，上調ATG16L1，從而引起細胞自噬活化。此外，Targetscan、miRDB網站預測自噬相關基因、UNC-51樣激酶1（UNC-51 like kinase 1，）、、等均為miR-20a下游潛在靶點，然而qRT-PCR和Western blotting檢測結果顯示雷公藤甲素對肝細胞中這些潛在靶點的表達無明顯影響，提示上述自噬相關基因可能在雷公藤甲素引起的肝細胞自噬活化過程中未發揮關鍵作用。研究表明，多種機制參與雷公藤甲素調節miRNA表達。雷公藤甲素通過干預轉錄因子Smad2/3的磷酸化，阻斷其于Smad4的結合及入核運輸，從而抑制轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）引起的miR-30表達下調[31]。雷公藤甲素還能夠抑制c-myc轉錄活性，阻斷miR-7-92和miR-106b-25的轉錄[32]。今后的工作將探討雷公藤甲素調節miR-20a表達的分子機制或信號通路。

細胞自噬對于細胞生存具有兩面性。正常條件下，細胞自噬活性維持在較低水平。外界刺激可以增強細胞自噬活性，發揮降解蛋白質或細胞器、維持代謝平衡和促細胞生存的功能。另一方面，過度活化的細胞自噬則導致細胞功能受損，引起自噬性死亡[33]。本實驗在體外條件下證明了利用miR-20a mimics或自噬抑制劑氯喹處理較雷公藤甲素單獨處理可進一步降低正常肝細胞的存活率，促進LDH釋放及細胞凋亡，加劇雷公藤甲素引起的肝細胞毒性，而miR-20a inhibitor則具有緩解雷公藤甲素肝毒性的效應，說明細胞自噬是肝細胞受到雷公藤甲素處理時激發的一種保護性機制，而阻斷細胞自噬途徑則可能影響體內活性氧或受損傷的細胞器清除能力，拮抗其對雷公藤甲素引起肝細胞凋亡的緩解作用，從而進一步加劇肝細胞毒性[34]。今后將嘗試在體內條件下驗證miR-20a是否通過自噬途徑對雷公藤甲素肝毒性發揮調控效應。過表達ATG16L1能夠部分逆轉過表達miR-20a mimics對雷公藤甲素肝毒性的影響，一方面驗證了ATG16L1在miR-20a調節雷公藤甲素肝毒性中發揮重要作用，另一方面說明miR-20a的其他潛在靶點可能參與了其對雷公藤甲素肝毒性的調節作用[26-27]。未來有必要探討miR-20a的其他下游靶基因是否在雷公藤甲素肝毒性中發揮作用。

綜上，本研究觀察了雷公藤甲素對正常肝細胞及小鼠肝組織中miR-20a及其下游靶基因表達的影響，結果驗證了在體外條件下miR-20a通過ATG16L1影響自噬過程，并參與調節雷公藤甲素肝細胞毒性，為闡明雷公藤甲素肝毒性的作用機制及miR-20a作為雷公藤甲素肝毒性的新型生物標記物提供了參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Xi C, Peng S J, Wu Z P,. Toxicity of triptolide and the molecular mechanisms involved [J]., 2017, 90: 531-541.

[2] Li Y J, Lia S, Xuea X Y,. Integrating systematic pharmacology-based strategy and experimental validation to explore mechanism ofglycoside on cholangiocyte-related liver injury [J]., 2022, 14(4): 563-575.

[3] Hu Y Q, Wu Q G, Wang Y L,. The molecular pathogenesis of triptolide-induced hepatotoxicity [J]., 2022, 13: 979307.

[4] Wei Y M, Wang Y H, Xue H Q,. Triptolide, A potential autophagy modulator [J]., 2019, 25(3): 233-240.

[5] 李彥, 付濱, 梁丙楠. 雷公藤肝毒性作用機制研究進展[J]. 天津中醫藥, 2017, 34(5): 358-360.

[6] Zhang L L, Li C Q, Fu L,. Protection of catalpol against triptolide-induced hepatotoxicity by inhibiting excessive autophagy via the PERK-ATF4-CHOP pathway [J]., 2022, 10: e12759.

[7] Wei Y M, Luan Z H, Liu B W,. Autophagy in triptolide-mediated cytotoxicity in hepatic cells [J]., 2019, 38(5): 436-444.

[8] Huo J T, Yu Q W, Zhang Y,. Triptolide-induced hepatotoxicity via apoptosis and autophagy in zebrafish [J]., 2019, 39(11): 1532-1540.

[9] 許可嘉, 張天嬌, 韓森, 等. 細胞自噬參與雷公藤甲素誘導的肝細胞損傷 [J]. 現代生物醫學進展, 2016, 16(26): 5012-5014.

[10] Menon A, Abd-Aziz N, Khalid K,. miRNA: A promising therapeutic target in cancer [J]., 2022, 23(19): 11502.

[11] Zhou K, Chang Y X, Han B,. MicroRNAs as crucial mediators in the pharmacological activities of triptolide (Review) [J]., 2021, 21(5): 499.

[12] 曾征鵬, 蔡金文, 廖毓梅, 等. MicroRNA-21通過自噬影響疾病的研究進展 [J]. 中南大學學報: 醫學版, 2022, 47(7): 936-941.

[13] Li Y, Zhou D M, Ren Y H,. Mir223 restrains autophagy and promotes CNS inflammation by targeting ATG16L1 [J]., 2019, 15(3): 478-492.

[14] 魏硯明, 任晉宏, 欒智華, 等. 多種細胞自噬調節劑對自噬標記物LC3II及p62表達的影響 [J]. 中國藥科大學學報, 2018, 49(3): 341-347.

[15] Mizushima N, Yoshimori T. How to interpret LC3 immunoblotting [J]., 2007, 3(6): 542-545.

[16] 呂曉希, 胡卓偉. 自噬流的檢測方法 [J]. 藥學學報, 2016, 51(1): 45-51.

[17] Wang Z, Wu Q, Li C Y,. Quantitative determination of autophagy flux by probes [J]., 2021, 164: 157-165.

[18] 吳若霞, 李正陽, 任婷, 等. 加味丹參飲結合微小核糖核酸21對大鼠心肌細胞的保護機制 [J]. 中國臨床藥理學雜志, 2020, 36(1): 61-64.

[19] Kimura T, Takabatake Y, Takahashi A,. Chloroquine in cancer therapy: A double-edged sword of autophagy [J]., 2013, 73(1): 3-7.

[20] Feng Y, Zheng C Y, Zhang Y J,. Triptolide inhibits preformed fibril-induced microglial activation by targeting the microRNA155-5p/SHIP1pathway [J]., 2019, 2019: 6527638.

[21] Xue M, Cheng Y, Han F,. Triptolide attenuates renal tubular epithelial-mesenchymal transition via the miR-188-5p-mediated PI3K/AKT pathway in diabetic kidney disease [J]., 2018, 14(11): 1545-1557.

[22] Zhang H, Liang J L, Chen N. The potential role of miRNA-regulated autophagy in Alzheimer’s disease [J]., 2022, 23(14): 7789.

[23] Korkmaz G, le Sage C, Tekirdag K A,. MiR-376b controls starvation and mTOR inhibition-related autophagy by targeting ATG4C and BECN1 [J]., 2012, 8(2): 165-176.

[24] Zhang J, Wang P Y, Wan L,. The emergence of noncoding RNAs as Heracles in autophagy [J]., 2017, 13(6): 1004-1024.

[25] D'Adamo S, Cetrullo S, Minguzzi M,. MicroRNAs and autophagy: Fine players in the control of chondrocyte homeostatic activities in osteoarthritis [J]., 2017, 2017: 3720128.

[26] Che J, Wang W S, Huang Y,. MiR-20a inhibits hypoxia-induced autophagy by targeting ATG5/FIP200 in colorectal cancer [J]., 2019, 58(7): 1234-1247.

[27] Yu Y B, Zhang J, Jin Y Q,. MiR-20a-5p suppresses tumor proliferation by targeting autophagy-related gene 7 in neuroblastoma [J]., 2018, 18: 5.

[28] Hamaoui D, Subtil A. ATG16L1 functions in cell homeostasis beyond autophagy [J]., 2022, 289(7): 1779-1800.

[29] Guo L, Zhao J, Qu Y L,. MicroRNA-20a inhibits autophagic process by targeting ATG7 and ATG16L1 and favors mycobacterial survival in macrophage cells [J]., 2016, 6: 134.

[30] Sun K T, Chen M Y, Tu M G,. MicroRNA-20a regulates autophagy related protein-ATG16L1 in hypoxia-induced osteoclast differentiation [J]., 2015, 73: 145-153.

[31] Yang Q Q, Sun M J, Chen Y,. Triptolide protects podocytes from TGF-β-induced injury by preventing miR-30 downregulation [J]., 2017, 9(11): 5150-5159.

[32] Li S G, Shi Q W, Yuan L Y,. C-Myc-dependent repression of two oncogenic miRNA clusters contributes to triptolide-induced cell death in hepatocellular carcinoma cells [J]., 2018, 37(1): 51.

[33] Napoletano F, Baron O, Vandenabeele P,. Intersections between regulated cell death and autophagy [J]., 2019, 29(4): 323-338.

[34] Gao Q. Oxidative stress and autophagy [J]., 2019, 12(6): 179-198.

miR-20a regulates autophagy by targeting ATG16L1 and involved in triptolide-induced hepatotoxicity

ZHANG Cai-xia, WANG Wei-yan, LI Hui-fang, DU Chen-hui, LIU Shan, WEI Yan-ming

College of Chinese Medicine and Food Engineering, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, China

To validate the effect of triptolide on miR-20a and autophagy related 16 like protein1 (ATG16L1) expressions and evaluate the regulatory role of miR-20a in triptolide-induced hepatotoxicity.HL7702 cells and C57BL/6J mice were treated with triptolide, and thenand ATG16L1 levels were detected by qRT-PCR and Western blotting. After HL7702 cells exposure to triptolide and simultaneous transfection with miR-20a mimics or inhibitor, ATG16L1 and microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3Ⅱ) expressions were detected by qRT-PCR and Western blotting; Cell survival rate was detected by CCK-8 method; The release of lactate dehydrogenase (LDH) was detected by kit; The activities of cystein-asparate protease-3 (Caspase-3) and Caspase-9 were detected by ELISA.Triptolide significantly down-regulatedexpression in normal liver cells or mouse liver tissues (< 0.05), as well as upregulated ATG16L1 and LC3Ⅱ expressions (< 0.05). miR-20a mimics significantly reversed the elevated ATG16L1 and LC3Ⅱ expressions induced by triptolide (< 0.05), further exacerbated triptolide-elicited decrease in cell viability (< 0.05), increase in lactate dehydrogenase leakage and activation of apoptosis proteases Caspase-3 and Caspase-9 (< 0.05), whereas miR-20a inhibitor exhibited opposite effects.miR-20a plays a regulatory role on triptolide-mediated hepatotoxicity by targeting ATG16L1 to affect autophagy.

triptolide; hepatotoxicity; autophagy; miR-20a; ATG16L1; apoptosis

R285.5

A

0253 - 2670(2023)13 - 4214 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.014

2023-02-09

山西省科技廳基礎研究課題資助項目（202103021224295）；山西中醫藥大學毒效關系研究創新團隊（2022TD1016）；山西中醫藥大學科技創新能力培養計劃“基礎研究專項”課題資助項目（2020PY-JC-17）

張彩霞，碩士研究生，研究方向為中藥新產品開發與應用。E-mail: 2303537480@qq.com

通信作者：魏硯明，副教授，碩士生導師，從事中藥藥理與毒理研究。Tel: (0351)3179717 E-mail: weiyanming2005@aliyun.com

[責任編輯 李亞楠]