哈巴俄苷通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路減輕神經(jīng)炎癥誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷

郝任娟，胡穎超，于顧然，秦秀德，陸韻薇

哈巴俄苷通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路減輕神經(jīng)炎癥誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷

郝任娟1，胡穎超2，于顧然2，秦秀德3，陸韻薇3*

1. 廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510030 2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029 3. 深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518000

研究哈巴俄苷對神經(jīng)炎癥誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的作用。采用MTT檢測血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）和哈巴俄苷對小鼠小膠質(zhì)BV2細(xì)胞活性的影響；觀察BV2細(xì)胞的形態(tài)變化；檢測細(xì)胞上清液中炎癥因子水平；采用免疫熒光檢測核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）核易位以及CD86、髓系細(xì)胞觸發(fā)受體2（triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2）的表達(dá)；采用Western blotting檢測Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）、髓樣分化因子88（molecule myeloid differentiation factor 88，MyD88）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）蛋白表達(dá)。分別使用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和TLR4抑制劑（TAK-242）進(jìn)一步驗證哈巴俄苷的作用機制。建立BV2-HT22細(xì)胞共培養(yǎng)模型，檢測線粒體膜電位、細(xì)胞凋亡情況以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，研究哈巴俄苷對神經(jīng)炎癥引起的神經(jīng)元損傷的影響。Ang II顯著上調(diào)BV2細(xì)胞TLR4、MyD88、IL-1β、TNF-α和iNOS蛋白表達(dá)（＜0.01、0.001），促進(jìn)NF-κB p65入核（＜0.001），調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞表面炎癥標(biāo)志物CD86和TREM2的表達(dá)（＜0.05）。哈巴俄苷和TAK-242可逆轉(zhuǎn)Ang II或LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞的作用（＜0.05、0.01、0.001）。此外，哈巴俄苷可顯著下調(diào)BV2-HT22共培養(yǎng)模型HT22細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)（＜0.01、0.001），抑制HT22細(xì)胞凋亡（＜0.05、0.001）。哈巴俄苷可能通過抑制Ang II誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞TLR4/MyD88/ NF-κB通路的激活來減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而緩解炎癥引起的神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。

哈巴俄苷；血管緊張素II；神經(jīng)炎癥；凋亡；共培養(yǎng)

高血壓為腦小血管病最常見的發(fā)病原因，研究表明血壓的過度波動會對大腦產(chǎn)生影響，與認(rèn)知障礙、中風(fēng)及癡呆的發(fā)生有關(guān)[1-2]。血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）可引起高血壓的發(fā)生，可與體內(nèi)的腎素血管緊張素（renin angiotensin system，RAS）效應(yīng)系統(tǒng)結(jié)合并引起慢性激活，導(dǎo)致機體多個系統(tǒng)的血管和組織炎癥和穩(wěn)態(tài)失衡[3-4]。Ang II可以誘導(dǎo)腦中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)炎癥以及認(rèn)知損傷[4]。完整的血腦屏障可阻止Ang II入腦，而持續(xù)的高血壓可以增加血腦屏障的通透性，引起Ang II持續(xù)入腦以及病理反應(yīng)的發(fā)生[5]。

炎癥反應(yīng)是一把“雙刃劍”，適量的炎癥因子可以通過清除有害物質(zhì)發(fā)揮保護(hù)作用，而其過度釋放則會破壞細(xì)胞和組織的穩(wěn)態(tài)。許多研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞可維持神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)[6-8]，參與大腦中的炎癥反應(yīng)[9]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可激活小膠質(zhì)細(xì)胞并促進(jìn)腦中炎性因子等有害物質(zhì)的產(chǎn)生，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[10]。Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）作為模式識別受體可被小膠質(zhì)細(xì)胞識別[11-12]，其主要在神經(jīng)系統(tǒng)中的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，與炎癥反應(yīng)調(diào)控有關(guān)[13-14]。TLR4在小膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)，用于監(jiān)測炎癥反應(yīng)[11]。研究證明TLR4通路已成為Ang II誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化及細(xì)胞炎癥因子產(chǎn)生的潛在作用機制[15]。核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）位于TLR4信號通路的下游，可介導(dǎo)多種炎癥過程[16]。TLR4可以招募下游信號分子髓樣分化因子88（molecule myeloid differentiation factor 88，MyD88），促進(jìn)NF-κB入核，誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、一氧化氮合酶等炎性介質(zhì)的釋放[12,17-18]。

哈巴俄苷為環(huán)烯醚萜類化合物，是玄參Hemsl.的主要活性成分，可用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病等多種疾病[19-20]。課題組前期已證明哈巴俄苷可通過抑制氧化損傷，上調(diào)bEnd.3細(xì)胞連接蛋白以減輕Ang II誘導(dǎo)的血腦屏障損傷[21]，尚未發(fā)現(xiàn)哈巴俄苷對Ang II誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化及神經(jīng)元損傷的研究。本研究以Ang II處理小鼠小膠質(zhì)BV2細(xì)胞并構(gòu)建BV2-小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞模型，探討哈巴俄苷的抗炎作用及神經(jīng)保護(hù)作用，并進(jìn)一步研究其相關(guān)機制。

1 材料

1.1 細(xì)胞

BV2細(xì)胞購自CoBioer Biosciences生物；HT22細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

哈巴俄苷（批號MUST-19082120，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自成都曼斯特生物有限公司，溶于PBS配制濃度8 mmol/L于?80 ℃保存；Ang II（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥93%，批號HY-13948）、LPS（批號HY-D1056）、TLR4抑制劑TAK-242（批號HY-11109）購自MCE公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號67-68-5）、MTT（批號298-93-1）購自美國Sigma公司；IL-1β ELISA試劑盒（批號88-7013）、TNF-α ELISA試劑盒（批號88-7324）、FITC-CD86單克隆抗體（批號11-0862-82）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；NO試劑盒（批號S0021S）、JC-1熒光探針（批號C2003S）購自上海碧云天生物；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒（批號A211-01/02）、TUNEL染色（批號A113-01/02/03）購自南京諾唯贊生物公司；鬼筆環(huán)肽（批號CA1610）購自北京索萊寶生物公司；DMEM-F12培養(yǎng)基（批號31331093）、DMEM培養(yǎng)基（批號11965092）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號10091）購自美國Gibco公司；TLR4抗體（批號66350-1-Ig）、MyD88抗體（批號66660-1-Ig）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗體（批號18985-1-AP）、TNF-α抗體（批號17590-1-AP）、Caspase-3抗體（批號19677-1-AP）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號12789-1-AP）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號50599-2-Ig）、NF-κB p65抗體（批號10745-1-AP）、髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體2（triggering receptor expressed on myeloid cell 2，TREM2）抗體（批號13483-1-AP）、離子鈣結(jié)合適配器分子-1（ionized calcium binding adapter molecule-1，Iba-1）抗體（批號10904-1-ap）、β-actin抗體（批號66009-1-Ig）、CoraLite488-conjugated羊抗兔/鼠IgG抗體（批號SA00013-2）購自Proteintech公司；IL-1β抗體（批號31202S）、Caspase-8抗體（批號4790）、Caspase-9抗體（批號9508）、細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt C）抗體（批號11940）購自美國CST公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號ZB-2301）、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（批號ZB-2305）購自北京中杉金橋生物。

1.3 儀器

1300A2型生物安全柜、HERA cell 1501型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Heraeus Fresco21離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；CKX41型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；ELX800型酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）；電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀（北京六一儀器廠）；CHEMIDOC XRS+凝膠系統(tǒng)成像儀（美國Bio-Rad公司）；FACSCelesta型分析型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；DS-Qi2型正置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

BV2細(xì)胞用含10% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基，HT22細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2天換液，當(dāng)細(xì)胞生長至80%密度時，用于后續(xù)實驗。

2.2 MTT法檢測細(xì)胞活性

BV2細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，之后加入不同濃度的Ang II（0、0.001、0.01、0.1、1 μmol/L）或哈巴俄苷（0、0.1、1、10、50、75、100、150、200、300 μmol/L），以加入DMSO作為空白，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入10 μL MTT溶液，于37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，加入DMSO充分震蕩10 min，采用酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度（）值，計算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(實驗－調(diào)零)/(空白－調(diào)零)

2.3 Ang II誘導(dǎo)BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的劑量篩選

BV2細(xì)胞以5×105/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度（0、0.001、0.01、0.1、1 μmol/L）的Ang II處理24 h。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，加入裂解液，冰上裂解細(xì)胞20～30 min，收集細(xì)胞液，超聲3次，每次15 s，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液為細(xì)胞總蛋白。用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，加入上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)10%～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉60 min，分別加入TLR4、MyD88、iNOS、TNF-α、IL-1β和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3次，加入二抗，室溫孵育60 min；TBST洗滌3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，采用Image Lab軟件分析條帶灰度。

2.4 鬼筆環(huán)肽染色檢測哈巴俄苷對Ang II誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞形態(tài)變化的影響

羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可以特異地與真核細(xì)胞中的肌動蛋白結(jié)合，從而表示細(xì)胞骨架分布。BV2細(xì)胞接種于含細(xì)胞爬片的12孔板中，培養(yǎng)24 h后加入0、50、75、100 μmol/L的哈巴俄苷預(yù)保護(hù)處理，2 h后加入0.1 μmol/LAng II處理24 h。棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞2次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.5% Triton X-100室溫通透20 min，鬼筆環(huán)肽避光孵育30 min，DAPI染色3 min，細(xì)胞封片后，正置熒光顯微鏡下觀察。

2.5 ELISA和Griess法檢測哈巴俄苷對Ang II誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞上清液中炎癥因子水平的影響

BV2細(xì)胞以5×105/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，加入0、50、75、100 μmol/L的哈巴俄苷或TAK-242（1 μmol/L）預(yù)保護(hù)處理2 h，之后加入0.1 μmol/LAng II處理24 h。離心收集上清，按照ELISA試劑盒說明書測定細(xì)胞上清液中IL-1β和TNF-α水平，通過Griess法檢測上清液中NO含量。

2.6 Western blotting檢測哈巴俄苷對BV2細(xì)胞TLR4/MyD88通路蛋白表達(dá)的影響

BV2細(xì)胞以5×105/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，加入0、50、75、100 μmol/L的哈巴俄苷或TAK-242（1 μmol/L）預(yù)保護(hù)處理2 h，之后加入0.1 μmol/LAng II或1 mg/mL LPS處理24 h。收集細(xì)胞，按“2.3”項下方法檢測TLR4、MyD88、iNOS、TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)。

2.7 免疫熒光染色檢測哈巴俄苷對BV2細(xì)胞NF-κB p65、TREM2和Iba-1蛋白表達(dá)的影響

BV2細(xì)胞以1×104/孔接種于12孔板中，培養(yǎng)24 h，加入0、100 μmol/L的哈巴俄苷或TAK-242（1 μmol/L）預(yù)保護(hù)處理2 h，之后加入0.1 μmol/LAng II或1 mg/mL LPS處理24 h。PBS洗滌后，4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.3% Triton X-100室溫通透20 min，加入免疫熒光染色封閉液，于搖床上室溫封閉60 min；滴加NF-κB p65（1∶500）、TREM2（1∶500）、Iba-1（1∶500）抗體，4 ℃孵育過夜；PBST洗滌3次，滴加熒光二抗，室溫避光孵育60 min，PBST洗滌3次，DAPI染色10 min，PBST洗滌3次，每次10 min，扣片并用指甲油封片，于正置熒光顯微鏡下拍照。

2.8 BV2-HT22共培養(yǎng)模型構(gòu)建

先單獨培養(yǎng)BV2細(xì)胞，用不同濃度的哈巴俄苷處理BV2細(xì)胞2 h，之后加入Ang II進(jìn)一步刺激。同時單獨培養(yǎng)HT22細(xì)胞于Transwell小室下層，Ang II刺激BV2細(xì)胞24 h后收集BV2細(xì)胞置于Transwell小室上層，與HT22細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，之后用于后續(xù)實驗。

2.9 MTT法檢測哈巴俄苷對共培養(yǎng)模型HT22細(xì)胞活性的影響

BV2-HT22細(xì)胞共培養(yǎng)體系加入50、75、100 μmol/L哈巴俄苷或TAK-242（1 μmol/L），加入10 μL MTT溶液，按“2.2”項下方法測定細(xì)胞活性。

2.10 JC-1染色檢測BV2-HT22共培養(yǎng)模型線粒體膜電位變化

JC-1探針用于檢測細(xì)胞線粒體膜電位的變化。JC-1聚集在正常細(xì)胞的線粒體中，激發(fā)出紅色熒光，而當(dāng)線粒體膜電位去極化時，JC-1以綠色單體的形式存在。一般情況下，綠色熒光的增加和紅色熒光的減少表明細(xì)胞凋亡[22-23]。BV2-HT22細(xì)胞共培養(yǎng)體系加入50、75、100 μmol/L哈巴俄苷或TAK-242（1 μmol/L），加入JC-1工作液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。PBS洗滌3次后，于正置熒光顯微鏡下觀察JC-1單體及聚集物的相對變化。采用Image J軟件進(jìn)行分析。

2.11 TUNEL染色檢測共培養(yǎng)模型細(xì)胞凋亡情況

BV2-HT22細(xì)胞共培養(yǎng)體系加入100 μmol/L哈巴俄苷或TAK-242（1 μmol/L），用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞，3% TritonX-100室溫通透細(xì)胞，37 ℃與TUNEL染色液反應(yīng)60 min，然后室溫下與DAPI染色10 min，PBS洗滌3次后，于正置熒光顯微鏡下觀察。細(xì)胞核中紅色熒光的增加表明細(xì)胞凋亡。

2.12 Annexin V-FITC/PI染色檢測共培養(yǎng)模型細(xì)胞凋亡情況

BV2-HT22細(xì)胞共培養(yǎng)體系加入100 μmol/L哈巴俄苷或TAK-242（1 μmol/L），用不含EDTA的胰酶消化并收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞3次，然后用Binding buffer對細(xì)胞進(jìn)行重懸，分別用Annexin V-FITC和PI染色液對細(xì)胞進(jìn)行染色，室溫避光孵育10 min，加入400 μL Binding buffer。用BD流式細(xì)胞分選儀進(jìn)行檢測，采用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)。

2.13 Western blotting檢測共培養(yǎng)模型細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

BV2-HT22細(xì)胞共培養(yǎng)體系加入100 μmol/L哈巴俄苷或TAK-242（1 μmol/L），收集細(xì)胞，按“2.3”項下方法提取蛋白，并檢測Caspase-3、Bax、Bcl-2、Caspase-8、Caspase-9、Cyt C蛋白表達(dá)。

2.14 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 Ang II和哈巴俄苷對BV2細(xì)胞活性的影響

如圖1所示，不同濃度（0.001、0.01、0.1、1 μmol/L）的Ang II對BV2細(xì)胞活性無顯著影響。如圖2所示，0～300 μmol/L的哈巴俄苷對BV2細(xì)胞活性也無顯著影響，因此選擇50、75、100 μmol/L的哈巴俄苷進(jìn)行后續(xù)實驗。

3.2 Ang II對BV2細(xì)胞TLR4/MyD88通路蛋白表達(dá)的影響

為了確定Ang II誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的最佳濃度，采用Western blotting檢測不同濃度的Ang II對BV2細(xì)胞TLR4/MyD88通路蛋白表達(dá)的影響，如圖3所示，Ang II能夠劑量相關(guān)性地誘導(dǎo)BV2細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，隨著濃度增加，TLR4、MyD88及炎癥相關(guān)蛋白IL-1β、TNF-α、iNOS的表達(dá)逐漸升高，以0.1 μmol/L Ang II組的表達(dá)量最高（＜0.05、0.01、0.001）。由于0.1 μmol/L Ang II對BV2細(xì)胞活力無損傷，且具有最明顯的促炎作用，因此選擇0.1 μmol/L Ang II作為后續(xù)模型誘導(dǎo)濃度。

圖1 Ang II對BV2細(xì)胞活性的影響(, n = 3)

圖2 哈巴俄苷對BV2細(xì)胞活性的影響(, n = 3)

3.3 哈巴俄苷對Ang II誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞形態(tài)變化的影響

如圖4所示，Ang II可以誘導(dǎo)BV2細(xì)胞形態(tài)改變，表現(xiàn)為阿米巴樣形態(tài)；而哈巴俄苷可以抑制BV2細(xì)胞形態(tài)的變化，表明其可以抑制細(xì)胞的活化，并呈劑量相關(guān)性。

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

圖4 哈巴俄苷對Ang II誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞形態(tài)變化的影響 (×200)

3.4 哈巴俄苷對Ang II誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞上清液中炎癥因子水平的影響

如圖5所示，與對照組比較，Ang II顯著誘導(dǎo)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β的分泌（＜0.01），促進(jìn)NO的生成（＜0.01），而哈巴俄苷的干預(yù)可以減少上述炎癥相關(guān)產(chǎn)物的合成（＜0.01），TLR4通路抑制劑TAK-242也表現(xiàn)出與哈巴俄苷相似的保護(hù)作用。

3.5 哈巴俄苷對BV2細(xì)胞TLR4/MyD88通路蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，75、100 μmol/L的哈巴俄苷顯著抑制Ang II誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中TLR4、MyD88、iNOS、TNF-α和IL-1β表達(dá)（＜0.05、0.01、0.001）。

為了進(jìn)一步驗證哈巴俄苷對TLR4/MyD88通路的作用，以小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4激動劑LPS（1 mg/mL）[18]以及TLR4通路抑制劑TAK-242（1 μmol/L）[24]處理細(xì)胞，如圖7、8所示，結(jié)果顯示100 μmol/L的哈巴俄苷可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4/MyD88通路的激活及炎癥產(chǎn)物的釋放（＜0.05、0.01、0.001），與TAK-242表現(xiàn)出相似的作用。此外，對于Ang II誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞，哈巴俄苷和TAK-242均表現(xiàn)出相似的保護(hù)作用。

與模型組（Ang II或LPS）比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001，下圖同

圖6 哈巴俄苷對Ang II誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞TLR4/MyD88通路蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

圖7 哈巴俄苷對LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞TLR4/MyD88通路蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

圖8 哈巴俄苷和TAK-242對Ang II誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞TLR4/MyD88通路蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

3.6 哈巴俄苷對NF-κB入核的影響

NF-κB是一種可被MyD88激活的核轉(zhuǎn)錄因子，其核異位的增加與炎癥反應(yīng)相關(guān)。通過NF-κB p65免疫熒光染色觀察其核異位情況，進(jìn)一步研究哈巴俄苷與NF-κB的關(guān)系。如圖9所示，Ang II和LPS均可誘導(dǎo)NF-κB p65的入核（＜0.01、0.001），而哈巴俄苷的干預(yù)可以減少NF-κB p65核異位（＜0.05、0.01），發(fā)揮抗炎作用。表明哈巴俄苷可以通過減少NF-κB p65的入核進(jìn)而抑制后續(xù)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)。因此，在Ang II誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中，哈巴俄苷可以通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路發(fā)揮抗炎作用。

圖9 哈巴俄苷對NF-κB p65入核的影響 (×400; , n = 3)

3.7 哈巴俄苷對BV2細(xì)胞CD86和TREM2表達(dá)的影響

通過免疫熒光染色進(jìn)一步觀察了哈巴俄苷對小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥標(biāo)志物CD86和TREM2表達(dá)的影響。如圖10、11所示，Ang II可以誘導(dǎo)CD86的上調(diào)以及TREM2的下調(diào)（＜0.05），而哈巴俄苷的作用相反，可以抑制CD86的表達(dá)并增加TREM2的表達(dá)（＜0.01），表現(xiàn)出保護(hù)作用。此外，LPS處理細(xì)胞可導(dǎo)致CD86的高表達(dá)以及TREM2的低表達(dá)（＜0.001），哈巴俄苷同樣表現(xiàn)出保護(hù)作用，抑制劑TAK-242也具有相似的保護(hù)作用。

3.8 哈巴俄苷對BV2-HT22共培養(yǎng)模型中HT22活性的影響

前述實驗證明哈巴俄苷可以抑制Ang II誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)，接下來構(gòu)建BV2-HT22共培養(yǎng)細(xì)胞模型觀察BV2的活化對細(xì)胞的損傷作用以及哈巴俄苷的藥理作用。通過MTT法檢測共培養(yǎng)模型中HT22細(xì)胞的活性。如圖12所示，Ang II顯著抑制共培養(yǎng)模型中HT22細(xì)胞的活性（＜0.001），誘導(dǎo)細(xì)胞損傷；100 μmol/L哈巴俄苷可以顯著升高細(xì)胞活力（＜0.05），減輕HT22細(xì)胞的損傷。

圖10 哈巴俄苷對CD86表達(dá)的影響(×400; , n = 3)

圖11 哈巴俄苷對TREM2表達(dá)的影響(×400; , n = 3)

圖12 哈巴俄苷對共培養(yǎng)模型中HT22細(xì)胞活性的影響(, n = 3)

3.9 哈巴俄苷對共培養(yǎng)模型中HT22細(xì)胞凋亡的影響

使用JC-1探針檢測線粒體膜電位的變化，如圖13所示，Ang II可以增加綠色熒光及紅色熒光的比值（＜0.001），而哈巴俄苷可以降低綠色熒光及紅色熒光的比值（＜0.001），增加線粒體膜電位，減少細(xì)胞凋亡。TUNEL染色結(jié)果（圖14）顯示哈巴俄苷可以減輕Ang II誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。細(xì)胞流式結(jié)果（圖15）也表明Ang II可明顯增加凋亡細(xì)胞的數(shù)量（＜0.01），而哈巴俄苷可以減少Ang II誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（＜0.05）。

3.10 哈巴俄苷對共培養(yǎng)模型中HT22凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Caspases家族可以調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡。進(jìn)一步分析共培養(yǎng)模型中HT22細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。如圖16所示，Ang II可明顯增加cleaved Caspase-3/ Caspase-3、cleaved Caspase-8/Caspase-8、cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bax/Bcl-2及Cyt C表達(dá)（＜0.01、0.001）；而用哈巴俄苷處理后，上述凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)均顯著降低（＜0.01、0.001），表明哈巴俄苷可在體外減少炎癥引起的神經(jīng)元損傷。

圖13 JC-1探針檢測線粒體膜電位變化(×400; , n = 3)

圖14 TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡 (×200)

4 討論

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的先天免疫細(xì)胞，在許多神經(jīng)退行性疾病中，其慢性激活可產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)以及有害物質(zhì)，導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡[11]。Ang II是高血壓的主要發(fā)病因素，其在體內(nèi)積累可導(dǎo)致血管和組織炎癥，與小膠質(zhì)細(xì)胞的激活有關(guān)，可促進(jìn)多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的進(jìn)展[4,25]。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性激活可能為高血壓腦小血管疾病的潛在治療靶點。本研究證明了哈巴俄苷可抑制BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免受炎癥損傷，而這可能是通過調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB通路來實現(xiàn)的。

圖15 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡(, n = 3)

小膠質(zhì)細(xì)胞在維持神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞的持續(xù)激活可在體內(nèi)產(chǎn)生高水平的有害介質(zhì)，包括TNF-α、IL-1β和iNOS，具有神經(jīng)毒性作用[11,26]。TLR4在小膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)，參與了多種神經(jīng)退行性疾病的小膠質(zhì)細(xì)胞激活[11]。激活的TLR4可募集下游的MyD88靶向NF-κB信號級聯(lián)[27]。Ang II可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，此外還可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4介導(dǎo)的信號通路[28-29]。Ang II可誘導(dǎo)TLR4、MyD88、iNOS、TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)量增加，促進(jìn)BV2上清中TNF-α、IL-1β和NO的分泌，誘導(dǎo)NF-κB p65向細(xì)胞核內(nèi)異位。因此，推測Ang II通過TLR4/MyD88/NF-κB通路激活小膠質(zhì)細(xì)胞，使用TLR4抑制劑TAK-242進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)TAK-242可產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)作用。

哈巴俄苷可調(diào)節(jié)體外3T3-L1脂肪細(xì)胞[30]、骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞[31]和BEAS-2B細(xì)胞[32]的炎癥反應(yīng)。本研究已證明Ang II可通過TLR4/MyD88/NF-κB通路激活BV2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。為了探索哈巴俄苷對小膠質(zhì)細(xì)胞的藥理作用，用哈巴俄苷預(yù)處理Ang II誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞。結(jié)果表明，哈巴俄苷可降低細(xì)胞中TLR4、MyD88、iNOS、TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)，減少BV2上清中TNF-α、IL-1β和NO的分泌，抑制NF-κB p65向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運，表現(xiàn)出與TAK-242相似的藥理作用。總之，哈巴俄苷可通過下調(diào)Ang II誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4/MyD88/ NF-κB通路激活發(fā)揮抗炎作用。TLR4可以識別多種病原體相關(guān)分子模式，LPS作為TLR4主要配體之一，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的其他細(xì)胞相比，主要作用于小膠質(zhì)細(xì)胞[11]。通常LPS與CD14蛋白結(jié)合并轉(zhuǎn)移到TLR4/MD-2復(fù)合物，靶向MyD88依賴的炎癥反應(yīng)[33]。因此，采用LPS進(jìn)一步研究哈巴俄苷對上述通路的作用。結(jié)果表明，100 μmol/L哈巴俄苷可抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞TLR4、MyD88、iNOS、TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)及NF-κB p65向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)運，與TAK-242的作用相同。即哈巴俄苷確實參與TLR4/MyD88/NF-κB通路。綜上，哈巴俄苷可抑制Ang II處理的BV2細(xì)胞TLR4/MyD88/NF-κB通路發(fā)揮抗炎作用。

圖16 共培養(yǎng)模型中HT22細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)(, n = 3)

研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞可極化為促炎M1型和抗炎M2型[11]。M1表型的小膠質(zhì)細(xì)胞與iNOS、TNF-α、IL-1β、CD86、主要組織相容性復(fù)合物II（major compatibility complex II，MHC-II）、IL-6等的上調(diào)有關(guān)，M2表型小膠質(zhì)細(xì)胞具有高水平的CD206、TREM2等[11,34]。TREM2主要在小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)，可減輕大腦炎癥[35]。通過觀察CD86和TREM2的表達(dá)分析小膠質(zhì)細(xì)胞的狀態(tài)，CD86的上調(diào)表示其促炎活性增加，而TREM2的表達(dá)在一定程度上起到了保護(hù)作用。結(jié)果顯示，在Ang II/LPS處理的小膠質(zhì)細(xì)胞中，CD86表達(dá)上調(diào)，TREM2表達(dá)下調(diào)。而哈巴俄苷和TAK-242預(yù)處理均可以抑制CD86的表達(dá)，增加TREM2的表達(dá)。因此，哈巴俄苷可能通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞CD86和TREM2的表達(dá)來抵抗Ang II或LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

BV2細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥分子可導(dǎo)致周圍神經(jīng)元細(xì)胞損傷[11]。為了進(jìn)一步驗證哈巴俄苷是否具有神經(jīng)保護(hù)作用，構(gòu)建了體外BV2-HT22細(xì)胞共培養(yǎng)模型。結(jié)果表明，哈巴俄苷可減輕共培養(yǎng)體系中HT22細(xì)胞的損傷，100 μmol/L哈巴俄苷、TAK-242與模型組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義。用100 μmol/L哈巴俄苷預(yù)處理共培養(yǎng)模型，分析由BV2細(xì)胞炎癥導(dǎo)致的HT22細(xì)胞凋亡。凋亡是一種細(xì)胞程序性死亡，主要由Caspases的激活引起。細(xì)胞凋亡途徑包括線粒體途徑和死亡受體途徑。死亡受體與其配體結(jié)合，激活并水解Caspase-8，進(jìn)一步激活下游的Caspase-3（死亡受體通路）。炎癥因子可改變線粒體膜通透性，影響促凋亡Bax家族和抗凋亡Bcl-2家族的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而激活Caspase-9（線粒體依賴途徑）。Caspase-8和Caspase-9均可激活Caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[36-38]。哈巴俄苷可降低Ang II誘導(dǎo)的共培養(yǎng)模型中HT22細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-8/ Caspase-8、cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bax/Bcl-2和Cyt C的表達(dá)。JC-1染色、TUNEL染色和流式細(xì)胞術(shù)也證實了哈巴俄苷可減少HT22細(xì)胞的凋亡。表明哈巴俄苷可能通過抑制線粒體通路和死亡受體通路，減輕Ang II介導(dǎo)的共培養(yǎng)模型中HT22細(xì)胞的凋亡（圖17）。

圖17 哈巴俄苷通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路減輕神經(jīng)炎癥誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷

綜上，哈巴俄苷可能通過抑制TLR4/MyD88/ NF-κB通路對Ang II誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用，進(jìn)而減輕神經(jīng)炎癥引起的神經(jīng)元損傷，表明哈巴俄苷在預(yù)防或治療高血壓腦小血管疾病及其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥疾病方面具有潛在的藥用價值。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Harpagoside alleviates neuronal damage caused by neuroinflammation via suppressing TLR4/MyD88/NF-κB pathway

HAO Ren-juan1, HU Ying-chao2, YU Gu-ran2, QIN Xiu-de3, LU Yun-wei3

1. Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine, Guangzhou 510030, China 2. Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, China 3. Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital, Shenzhen 518000, China

To study the effect of harpagoside on neuron injury induced by neuroinflammation.The effects of angiotensin II (Ang II) and harpagoside on viability of mouse microglia BV2 cells were detected by MTT assay; The morphological changes of BV2 cells was observed; The levels of inflammatory factors in cell supernatant were detected; The nuclear translocation of nuclear factor-κB p65 (NF-κB p65) and expressions of CD86 and triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (TREM2) in myeloid cells were detected by immunofluorescence; Toll like receptor 4 (TLR4) and myeloid differentiation factor 88 (MyD88), inducible nitric oxide synthase (iNOS), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) protein expressions were detected by Western blotting. Lipopolysaccharide (LPS) and TLR4 inhibitor (TAK-242) were used to further verify the mechanism of harpagoside. The co-culture model of BV2-HT22 cells was established, mitochondrial membrane potential, apoptosis and expressions of apoptosis-related proteins were detected to study the effect of harpagoside on neuronal damage caused by neuroinflammation.Ang II significantly increased the protein expressions of TLR4, MyD88, IL-1β, TNF-α and iNOS in BV2 cells (< 0.01, 0.001), promoted the nucleation of NF-κB p65 (< 0.001), and regulated the expressions of inflammatory markers CD86 and TREM2 on the surface of microglia (< 0.05). Harpagoside and TAK-242 could reverse the effects of Ang II or LPS on BV2 cells (< 0.05, 0.01, 0.001). In addition, harpagoside could significantly down-regulate the expressions of apoptosis-related proteins in HT22 cells of BV2-HT22 co-culture model (< 0.01, 0.001), and inhibit the apoptosis of HT22 cells (< 0.05, 0.001).Harpagoside may alleviate the inflammatory response by inhibiting the activation of TLR4/MyD88/ NF-κB pathway in BV2 cells induced by Ang II, thus alleviating the apoptosis of neurons caused by inflammation.

harpagoside; angiotensin II; neuroinflammation; apoptosis; co-culture

R285.5

A

0253 - 2670(2023)13 - 4202 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.013

2023-01-03

國家重點研發(fā)計劃項目（2022YFC3501403）；江蘇省自然科學(xué)基金資助項目（BK20191506）；深圳市“醫(yī)療衛(wèi)生三名工程”項目（SZZYSM202111011）

郝任娟（1996—），碩士研究生，主要從事神經(jīng)系統(tǒng)疾病的中醫(yī)藥研究。E-mail: 1320597106@qq.com

通信作者：陸韻薇（1990—），主治醫(yī)師，博士，主要從事神經(jīng)系統(tǒng)疾病的中醫(yī)藥研究。E-mail: 417213243@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]