入山虎不同提取部位抗類風濕性關節炎活性研究

曾英港，王柳萍, 2, 3*，奉建芳, 2, 3*，唐丹丹，蒙泔竹

入山虎不同提取部位抗類風濕性關節炎活性研究

曾英港1，王柳萍1, 2, 3*，奉建芳1, 2, 3*，唐丹丹1，蒙泔竹1

1. 廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530200 2. 江西中醫藥大學，江西 南昌 330004 3. 廣西優勢中成藥與民族藥開發工程技術研究中心，廣西 南寧 530020

考察入山虎var.不同提取部位對類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）的治療作用及提取部位的化學成分分析。考察入山虎不同提取部位對人RA成纖維樣滑膜MH7A細胞增殖活性和炎癥因子含量的影響，通過對大鼠足趾部皮內注射完全弗氏佐劑建立RA大鼠模型，測定大鼠體質量、全身評分、關節炎指數、足跖腫脹度、臟器系數、血清中炎癥因子含量，采用蘇木素-伊紅染色觀察踝關節組織病理，以評價入山虎不同提取部位的抗RA活性作用。采用UPLC-Q-TOF-MS/MS分析入山虎提取部位的化學成分。入山虎中的氯仿及石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水提取部位在體內外對RA均具有良好的抗炎作用。在體外，能夠抑制MH7A細胞的增殖（＜0.05、0.01），減少炎癥因子白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-17A、IL-1β的分泌（＜0.01）；在體內，入山虎的提取部位可不同程度降低RA大鼠的足跖腫脹度、全身評分及關節炎評分（＜0.05、0.01），改善踝關節的病理改變，緩解RA大鼠的炎癥反應，還能減少促炎因子IL-6、IL-17A、IL-1β的分泌（＜0.01），增加抗炎因子IL-4、IL-10的分泌（＜0.01）。對入山虎的提取部位進行化學成分分析，發現入山虎的提取物含有的化合物比較相似，含有生物堿、黃酮、香豆素等其他化合物，以生物堿類居多，主要包括呋喃喹啉類、芐基異喹啉類、原小檗堿類、阿樸啡類、苯并菲啶類、酰胺類等。入山虎中的氯仿及石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水部位在體內外對RA均具有良好的抗炎作用，入山虎提取物主要含有生物堿、黃酮、香豆素等其他化合物。

入山虎；不同提取部位；類風濕性關節炎；炎癥因子；生物堿；黃酮；香豆素；木蘭花堿；橙皮苷；兩面針堿

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的、病因未明的慢性自生免疫性疾病，病理學表現為滑膜增生，血管翳形成、炎癥細胞浸潤、軟骨侵蝕等，臨床表現為關節功能降低、關節疼痛、腫脹，最終造成關節畸形或者嚴重的殘疾[1-3]。目前，RA治療藥物主要為非甾體抗炎藥、改善風濕病情的藥物、糖皮質激素、生物制劑等，但這些藥物價格昂貴且伴有心血管和胃腸道出血、肝腎毒性和生長抑制等不良反應[4-6]。我國民族醫藥、中藥具有多成分、多靶點、不良反應小等特色優勢，在臨床及實驗研究中許多活性成分和作用機制得到了證實，具有良好的應用前景[7-9]。

入山虎為蕓香科植物毛葉兩面針(Roxb.) DC. var.Huang的干燥根和莖[10]，是傳統瑤藥“五虎”“九牛”“十八鉆”“七十二風”104種老班藥之首藥，臨床使用量較大。具有清熱解毒、消腫止痛、活血散瘀、殺蟲止癢的功效，用于治療風濕、RA、坐骨神經痛、胃痛、腹痛、牙痛、咽喉腫痛等。現代研究表明，入山虎含有生物堿、黃酮類等成分，具有抗菌、抗癌、抗炎、抗血栓等藥理活性[11-14]。但入山虎作為常用的抗RA瑤族民間草藥，其抗RA藥效物質基礎研究還很薄弱。因此，本實驗以入山虎為研究對象，探討其不同提取部位的抗RA活性，尋找活性較強的提取部位，并對入山虎的提取物進行化學成分分析，為入山虎的抗RA作用研究提供初步的科學依據，為抗RA藥物的研發提供參考。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，體質量180～220 g，6周齡，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號SCXK（湘）2019-0004。動物飼養于廣西中醫藥大學SPF級動物實驗室，實驗動物使用許可證SYXK（桂）2019-0001，飼養環境相對濕度50%，溫度（22±1）℃，光線控制12 h明暗交替，用標準顆粒飼料喂養并自由飲用滅菌水。動物實驗經廣西中醫藥大學倫理委員會批準（批準號DW20220526-114）。

1.2 細胞

人RA成纖維MH7A細胞（批號220303）購自北納生物科技有限公司。

1.3 藥材

入山虎藥材樣品購自廣西壯族自治區來賓市金秀瑤族自治縣桐木鎮草藥街，樣品均經過廣西中醫藥大學韋松基教授、朱意麟講師鑒定為蕓香科植物毛葉兩面針(Roxb.) DC. var.Huang的干燥根或莖。

1.4 藥品與試劑

DMEM培養基、0.25%胰酶-EDTA消化液、PBS（批號分別為8122082、2376021、8122063）購自美國Gibco公司；胎牛血清（批號T210420H501）購自賽業生物科技有限公司；青鏈霉素混合液（批號20211120）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號814O035）購自北京索萊寶科技有限公司；MTT（批號917Q0514）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；重組人腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α，批號031825）購自美國PEPROTECH公司；人白細胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒（批號分別為UX0728043972、UX08R02H5223、UX09PN026474）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；大鼠IL-6 ELISA試劑盒（批號MAN0016898）、大鼠IL-1β ELISA試劑盒（批號MAN0016903）、大鼠IL-4 ELISA試劑盒（批號MAN0016900）、大鼠IL-10 ELISA試劑盒（批號MAN0016902）、質譜純的純凈水（批號W6-4）、甲醇（批號A456-4）、乙腈（批號A955-4）、甲酸（批號A117-50）購自賽默飛世爾科技公司；大鼠IL-17A ELISA試劑盒（批號CSB-E07451r）購自武漢華美生物工程有限公司；甲氨蝶呤（methotrexate，MTX，批號036200804）購自上海上藥信誼藥廠有限公司；完全弗氏佐劑（批號F5881）購自美國Sigma公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，批號20211004）購自天津市大茂化學試劑廠；對照品兩面針堿（質量分數為99.81%）、二氫白屈菜紅堿（質量分數為99.21%）、鹽酸白屈菜紅堿（質量分數為99.41%）、鹽酸血根堿（質量分數為99.50%）、花椒堿（質量分數為99.94%）、毛兩面針素（質量分數為99.91%）、白鮮堿（質量分數為99.98%）、鹽酸巴馬汀（質量分數為98.75%）、鹽酸藥根堿（質量分數為99.50%）、木蘭花堿（質量分數為99.82%）、橙皮苷（質量分數為98.88%）均購自成都曼思特生物科技有限公司，批號依次為MUST-22111707、MUST-22032004、MUST-21101002、MUST-23022212、MUST-21101701、MUST-22121906、MUST-22100807、MUST-21022604、MUST-23022212、MUST-22020816、MUST-21042811；對照品茵芋堿（質量分數為99.62%）、鹽酸四氫巴馬汀（質量分數為99.97%）、飛龍掌血素（質量分數為99.50%）均購自成都普瑞法科技開發有限公司，批號分別為PRF10081202、PRF21102042、PRF20082821；去甲烏藥堿對照品（質量分數為97.00%，批號Y-115-150716）購自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.5 儀器

RE-5205型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；Alpha 2-4 LSCbasic型冰凍干燥機（德國Main Christ公司）；MCO-18AIC型CO2培養箱（三洋電機株式會社）；CK40型倒置顯微鏡（奧林巴斯株式會社）；SW-CJ-1FD型垂直凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；ST16R型低溫離心機、Multiskan Sky全波長酶標儀（賽默飛世爾科技公司）；MH-2型微型震蕩器（其林貝爾儀器制造有限公司）；SL01-1型游標卡尺（德清盛秦芯電子科技有限公司）。UPLC-H CLASS超快速液相色譜、XEVO-G2 S qtof四極桿飛行時間質譜、Savant? SPD131DDA SpeedVac?真空離心濃縮儀、Masslynx質譜數據采集軟件（美國Waters公司）。

2 方法

2.1 入山虎不同提取部位的制備

取入山虎根、莖粗粉8.5 kg于滲漉筒鋪平，加入10倍量0.8%稀鹽酸，浸漬3 d，滲漉，收集提取液，合并，加入氨水調節pH至10，抽濾得到生物堿沉淀，同時將濾液減壓濃縮，再用三氯甲烷根據生物堿的脂溶性將其萃取到氯仿層中，得到氯仿部位（總生物堿提取物）。

取8.5 kg入山虎根、莖粗粉用10倍量70%乙醇同上法滲漉，濃縮，得乙醇總提取物浸膏。按1∶2向乙醇總提取物浸膏中加入蒸餾水混懸，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇對混懸液萃取，濃縮，即得石油醚部位、醋酸乙酯部位、正丁醇部位以及水部位的提取物。

2.2 入山虎不同提取部位的體外抗RA活性研究

2.2.1 MTT檢測MH7A細胞增殖活性 取對數生長期的MH7A細胞，以5×103個/mL接種于96孔板，每孔100 μL，待細胞貼壁生長24 h后，給藥組分別加入不同質量濃度的氯仿提取液（終質量濃度為25.000 0、12.500 0、6.250 0、3.125 0、1.562 5、0.781 3、0.390 6 mg/mL），石油醚、水部位提取液（終質量濃度為6.250 0、3.125 0、1.562 5、0.781 3、0.390 6、0.195 3、0.097 7 mg/mL），醋酸乙酯部位提取液（終質量濃度為12.500 0、6.250 0、3.125 0、1.562 5、0.781 3、0.390 6、0.195 3 mg/mL），正丁醇部位提取液（終質量濃度為3.125 0、1.562 5、0.781 3、0.390 6、0.195 3、0.097 7、0.048 8 mg/mL），同時設置陰性對照組（有細胞、培養基、無藥物）以及空白組（僅有培養基），每組6個復孔，繼續培養24 h后，棄去培養液，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），繼續孵育4 h后，每孔加入150 μL DMSO，振蕩搖勻10 min，于570 nm處檢測各組的吸光度（）值，計算細胞的增殖抑制率和半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）。實驗重復3次。

細胞增殖抑制率＝1－(給藥－空白)/(陰性對照－空白)

2.2.2 ELISA檢測MH7A細胞上清液中炎癥因子含量 取對數生長期的MH7A細胞，以5×104個/mL接種在24孔板上，每孔500 μL，待24 h細胞貼壁，分別加入含有入山虎氯仿、石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水部位、MTX的培養基（質量濃度分別為IC50的1/2、1/4、1/8），空白組、模型組加入等體積的完全培養基，再加入TNF-α（終質量濃度為20 ng/mL），干預24 h，收集細胞上清液，于?20 ℃保存備用。按照試劑盒說明書測定上清液中IL-6、IL-17A和IL-1β的含量。

2.3 入山虎不同提取部位的體內抗RA活性研究

2.3.1 動物模型的構建、分組與給藥 按照參考文獻方法[15-17]，取96只SD雄性大鼠，適應性飼養7 d后，隨機分成空白組、模型組、MTX（0.5 mg/kg，2次/周）組、氯仿部位（6 g/kg，1次/d）組、石油醚部位（6 g/kg，1次/d）組、醋酸乙酯部位（6 g/kg，1次/d）組、正丁醇部位（6 g/kg，1次/d）組、水部位（6 g/kg，1次/d）組。除空白組，其余組大鼠右后足趾部皮內注射完全弗氏佐劑0.2 mL致炎。造模成功后，空白組和模型組ig 0.5% CMC-Na水溶液，其余組連續22 d ig相應藥物。

2.3.2 觀測指標

（1）體質量變化：每4天測定每只大鼠的體質量，并記錄。

（2）全身評分：造模成功后觀察并記錄各組大鼠后足關節病變程度，每4天進行1次全身評分，每只大鼠評分為0～8分，評分標準見表1。

（3）關節炎指數測定：造模成功后觀察并記錄各組大鼠后足關節病變程度，每4天進行1次關節炎評分。每只大鼠的關節炎指數評分為單只大鼠后足關節炎評分乘以4，評分標準見表2。

（4）RA大鼠足趾腫脹度測定：用游標卡尺測量全部大鼠右后足厚度，分別在注射佐劑前及造模成功后每4天進行測量，計算腫脹度。

腫脹度＝造模后足跖厚度－造模前足跖厚度

（5）臟器系數的測定：末次ig給藥后24 h，ip 20%烏拉坦溶液，隨后頸椎脫臼處死大鼠，快速取出大鼠的臟器，稱定質量，并計算臟器指數。

臟器指數＝臟器質量/體質量

表1 全身評分項目及標準

表2 關節炎指數評分標準

（6）組織病理學觀察：頸椎脫臼處死大鼠后，分離右足踝關節部位，脫水，石蠟包埋，切片，進行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

（7）ELISA法檢測RA大鼠血清中炎癥因子含量：大鼠ip 20%烏拉坦（1 g/kg），隨后頸椎脫臼處死大鼠，腹主動脈取血，4 ℃、3000 r/min離心10 min，分離血清，按照ELISA試劑盒說明書測定血清中IL-1β、IL-17A、IL-6、IL-4、IL-10含量。

2.4 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術分析入山虎提取物的化學成分

考慮到石油醚提取物大多數是低極性成分，主要為長鏈脂肪烴等成分，活性成分可能較少；水提取物大多是極性大的維生素、氨基酸等成分，活性成分可能也較少，同時因正丁醇、醋酸乙酯、氯仿提取物在體內外具有良好的抗RA活性，且極性中等，因此選擇正丁醇、醋酸乙酯、氯仿的提取物進行定性分析。

2.4.1 待測樣品的處理 取入山虎正丁醇、醋酸乙酯、氯仿提取物的浸膏1.0 g，加入20 mL甲醇溶解，取1 mL加甲醇定容到10 mL，用0.22 μm濾膜過濾后進樣分析。兩面針堿、二氫白屈菜紅堿、鹽酸白屈菜紅堿、鹽酸血根堿、花椒堿、毛兩面針素、白鮮堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、木蘭花堿、茵芋堿、鹽酸四氫巴馬汀、飛龍掌血素、去甲烏藥堿對照品均用甲醇配成100 μg/mL對照品儲備液，取對照品儲備液用甲醇稀釋制成10 μg/mL混合對照品溶液，即可。

2.4.2 色譜和質譜條件 Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～25 min，98%～55% A；25～32 min，55%～10% A；32～32.1 min，10%～98% A；32.1～35 min，98% A；體積流量0.3 mL/min；進樣量1.0 μL；柱溫40 ℃。

質譜分析采用Waters電噴霧離子源的四極桿飛行時間質譜分析儀。正離子源碰撞電壓分別為3 kV；離子源溫度100 ℃；脫溶劑溫度350 ℃；樣品錐孔電壓40 kV；萃取錐孔電壓4 kV；錐孔氣體積流量50 L/h；溶媒揮散體積流量600 L/h；掃描范圍/100～1200；低碰撞能量10 eV；高碰撞能量30 eV。采用MSE Continuum掃描模式（非數據依賴掃描模式）對化合物進行鑒定。液質系統、數據采集、定量處理由Masslynx 4.1軟件控制。

2.4.3 化合物定性 通過UPLC-Q-TOF-MS/MS平臺采集得到原始數據，采用Progenesis QI軟件對原始數據進行導入、峰對齊、峰提取、歸一化處理，最終形成保留時間、質荷比和峰強度的化合物庫，通過加氫和加鈉等均去卷積到每個離子特征。對一級質譜數據分析得到可能的分子式和候選化合物，通過二級質譜碎片，結合對照品的裂解規律及相關裂解途徑，文獻資料、質譜數據庫推導可能的骨架結構，及已報道的同科同屬兩面針化學成分相關研究推導最終的分子結構。

2.4.4 入山虎不同提取物化學成分差異分析 將入山虎不同提取物（每個提取物重復6個樣品）中的峰面積數據進行收集，以質譜離子流圖中峰的響應強度值作為相對定量的原數據。帕萊托換算（Paerto Scaling）是代謝組學中常用的換算方法，本研究采用帕萊托換算對原數據進行數據標度換算，將定量數據提交在線軟件Metaboanalyst 5.0進行聚類分析并繪制熱圖，以直觀分析入山虎不同提取物間化學成分的含量差異。

2.5 高效液相法測定化合物含量

2.5.1 色譜條件 Welch Ultimate XB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-水（B）溶液（含0.2%甲酸、0.25%三乙胺）為流動相進行梯度洗脫：0～5 min，15% A；5～10 min，15%～20% A；10～25 min，20%～35% A；25～35 min，35%～60% A；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；檢測波長271 nm。

2.5.2 混合對照品的制備 精密稱取木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿對照品適量，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色量瓶中，制成質量濃度分別為0.816 0、0.898 0、0.202 0 mg/mL的混合對照品溶液。并稀釋得到木蘭花堿的質量濃度分別為0.816 0、0.326 4、0.130 6、0.052 2、0.020 9 mg/mL，橙皮苷的質量濃度分別為0.898 0、0.143 7、0.057 5、0.023 0、0.009 2 mg/mL，兩面針堿的質量濃度分別為0.202 0、0.080 8、0.032 3、0.012 9、0.005 2 mg/mL的一系列混合對照品溶液，按上述色譜條件進樣分析。

2.5.3 供試品溶液的制備 取入山虎水部位提取物約l g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL超聲溶解，用0.22 μm微孔濾膜濾過，按上述色譜條件進樣分析。

3 結果

3.1 入山虎不同提取部位的體外抗RA活性

3.1.1 入山虎不同提取部位對MH7A細胞增殖的影響 如圖1所示，入山虎的不同提取部位對MH7A細胞均有抑制增殖的作用，氯仿、石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水部位的IC50分別為（6.421 8±0.479 3）、（2.252 0±0.357 8）、（6.886 2±0.177 3）、（1.307 0±0.098 1）、（5.479 7±0.393 7）mg/mL，IC50從大到小依次為醋酸乙酯、氯仿、水、石油醚、正丁醇部位。因入山虎不同提取部位IC50的1/2、1/4、1/8在一定質量濃度范圍內隨給藥濃度的增加，細胞增殖率下降越明顯，后續選擇IC50的1/2、1/4、1/8進行實驗。

與空白組（0 mg·mL?1）比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3.1.2 入山虎不同提取部位對MH7A細胞上清液中炎癥因子含量的影響 如圖2所示，在炎癥因子TNF-α的刺激下，與空白組比較，模型組IL-6、IL-17A、IL-1β含量顯著升高（＜0.01）；用入山虎不同提取部位干預后，與模型組比較，不同質量濃度的氯仿及石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水部位組IL-6、IL-17A、IL-1β含量均顯著減少（＜0.01）。

3.2 入山虎不同提取部位的體內抗RA作用

3.2.1 入山虎不同提取部位對RA大鼠體質量的影響 如圖3所示，模型組以及入山虎不同提取部位組的大鼠體質量均低于空白組（＜0.05、0.01），但入山虎各組大鼠體質量均呈現增長的趨勢，大鼠體質量也比較接近，提示入山虎不同提取部位對RA大鼠的體質量增長有一定的促進作用。

與空白組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01；L、M、H分別代表低、中、高劑量組，分別為IC50的1/8、1/4、1/2

與空白組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.2.2 入山虎不同提取部位對RA大鼠全身評分的影響 MTX組、石油醚組在6 d后全身評分均明顯低于模型組（＜0.05、0.01），氯仿組大鼠在10 d后全身評分均顯著低于模型組（＜0.01），在18～22 d，入山虎不同提取部位組的大鼠全身評分均低于模型組（＜0.05、0.01），全身評分的分數由低到高依次為氯仿組、石油醚、醋酸乙酯、水部位、正丁醇組，見圖3。

3.2.3 入山虎不同提取部位對RA大鼠關節炎指數的影響 與模型組比較，MTX組在6 d后大鼠的關節炎評分顯著降低（＜0.01），氯仿組在10 d后大鼠的關節炎評分顯著降低（＜0.01），石油醚組、醋酸乙酯組、正丁醇組在18 d后，能夠緩解RA大鼠的關節炎癥狀，明顯降低了大鼠的關節炎評分（＜0.05、0.01）。水部位組的RA大鼠關節炎癥狀在22 d也有改善（＜0.05）。關節炎指數評分由低到高依次為氯仿組、石油醚組、正丁醇組、醋酸乙酯組、水部位組，見圖3。

3.2.4 入山虎不同提取部位對RA大鼠足趾腫脹度的影響 采用完全弗氏佐劑在右后足趾皮內注射造模后，右后足趾開始逐漸變紅、腫脹明顯，在造模3、4 d左右達到峰值，腳趾關節間及前足趾出現關節腫大，觸及關節大鼠呈現疼痛反射，后肢伸屈不利，睡眠時右足趾不著地。在6 d后MTX組、氯仿組、石油醚組的RA大鼠腫脹度均明顯小于模型組（＜0.01）。在14 d后，醋酸乙酯組、正丁醇組的RA大鼠的腫脹度顯著低于模型組（＜0.05、0.01），而水部位組的RA大鼠在22 d后其右足腫脹度也有所改善，且低于模型組（＜0.05）。足跖腫脹度由低到高依次為石油醚組、氯仿組、正丁醇組、水部位組、醋酸乙酯組，見圖3。

3.2.5 入山虎不同部位對RA大鼠臟器指數的影響 如圖4所示，與空白組比較，模型組的脾臟指數和肝臟指數顯著增高（＜0.01），表現出一定的免疫亢進。與模型組比較，氯仿、石油醚、正丁醇、水提取部位組和MTX組均能夠降低RA大鼠的脾臟、肝臟指數（＜0.05、0.01）。醋酸乙酯組也具有降低RA大鼠的脾臟指數和肝臟指數的趨勢，但無顯著性差異。

3.2.6 入山虎不同部位對RA大鼠踝關節病理的影響 如圖5所示，空白組大鼠關節軟骨平整，關節腔內干凈，滑膜細胞及結締組織未見增生，未見明顯異常。模型組大鼠踝關節結締組織增生、可見被結締組織包裹的巨噬細胞團，局部關節軟骨損傷、可見一定量的結締組織增生，大量的炎性細胞浸潤，滑膜增生。ig入山虎不同提取物后，上述病理改變均得到不同程度的改善，尤其以氯仿組效果最為明顯。表明入山虎不同提取物具有良好的改善RA模型大鼠踝關節組織病變的作用，即具有較好的抗RA作用。

圖4 入山虎不同提取部位對RA大鼠脾臟和肝臟指數的影響(, n = 12)

圖5 入山虎不同提取部位對RA大鼠踝關節(A) 及滑膜組織(B) 病理變化的影響(HE, ×100)

3.2.7 入山虎不同提取部位對RA大鼠血清中致炎因子IL-1β、IL-6和IL-17A水平的影響 如圖6所示，與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-17A的含量明顯提高（＜0.01）；與模型組比較，MTX組以及入山虎的不同提取部位組能夠減少RA大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-17A的含量（＜0.01）。

3.2.8 入山虎不同提取部位對RA大鼠血清中抗炎因子IL-4和IL-10水平的影響 如圖7所示，與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-4、IL-10的含量明顯降低（＜0.01）；與模型組比較，入山虎提取部位中氯仿組以及MTX組的IL-4的含量均顯著升高（＜0.01），石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水部位組的IL-4的含量也有升高，但是差異不具有統計學意義。入山虎的不同提取部位組均能夠升高RA大鼠血清中的IL-10的含量（＜0.01）。其中，氯仿組IL-4、IL-10的含量與MTX組相當。

圖6 入山虎不同提取部位對RA大鼠血清中IL-1β、IL-6和IL-17A水平的影響(, n = 12)

圖7 入山虎不同提取部位對RA大鼠血清中IL-4和IL-10水平的影響(, n = 12)

3.3 入山虎提取部位的化學成分分析

參考兩面針藥材化學成分分析相關文獻報道[36]，本實驗選擇正離子模式進行分析，得到混合對照品及提取物的一級質譜基峰圖，見圖8。結合對照品圖譜中的保留時間、準分子離子、二級碎片離子信息、裂解規律，以及相關文獻報道[37-56]，最終初步篩選得到入山虎化合物69個，初步鑒定結構55個，未知14個。鑒定結果見表3，入山虎提取的化學成分比較相近，主要以生物堿類的成分居多，包括呋喃喹啉類、芐基異喹啉類、原小檗堿類、阿樸啡類、苯并菲啶類、酰胺類等生物堿以及黃酮、香豆素等其他化合物。

3.4 入山虎不同提取物化學成分差異分析結果

聚類熱圖（圖9）顯示，入山虎不同提取物的化學成分含量具有顯著差異，而不同提取物的重復樣品內的化學成分含量相似。結果顯示，68個化合物可以明顯地聚類成2個大類群。同時每個大類群又聚類成2個亞群。來自于大類群I中的2個亞群的化合物在醋酸乙酯提取物組的含量顯著高于氯仿和正丁醇組，氯仿組最低，同時2個亞群的代謝物又存在一定差異，即醋酸乙酯提取物中coptisine（52）、rutaecarpine（54）、去-甲基白屈萊紅堿（62）、二氫白屈菜紅堿（64）等的含量相對較高。而來自大類群II中亞群3的化合物在正丁醇提取物組中的含量顯著高于氯仿和醋酸乙酯組，正丁醇提取物中的橙皮苷（23）、四氫巴馬汀（24）、藥根堿（26）等的含量相對較高。而亞群4的化合物在氯仿提取物組的含量顯著高于正丁醇和醋酸乙酯組，亞群5的化合物在醋酸乙酯提取物組的含量顯著低于氯仿和正丁醇組，氯仿提取物中的去甲烏藥堿（1）、小檗紅堿（25）、兩面針堿（39）、茵芋堿（43）、白蘚堿（46）、木蘭花堿（8）等的含量相對較高。

A、B、C依次為正丁醇、醋酸乙酯、氯仿提取部位，D為混合對照品

表3 入山虎提取物的化學成分UPLC-Q-TOF-MS/MS鑒別結果

續表3

續表3

▲代表經過對照品比對，△參考文獻、數據庫數據，無標記表示無文獻參考

▲represents that after comparison of reference substances,△references literature and database data, unmarked means no literature reference

A、B、C依次為氯仿、醋酸乙酯、正丁醇提取部位

3.5 入山虎化合物定量結果

由“3.4”項下入山虎不同提取物的化學成分差異分析結果可知，木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿在入山虎提取物中的含量相對較高，在高效液相色譜儀中也能夠鑒定這個3個成分，因此，選擇木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿進行定量測定。

3.5.1 方法學考察結果

（1）線性考察：將混合對照品按“2.5.1”項下的色譜條件進樣測定，記錄木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿的峰面積。以質量濃度為橫坐標（）、以峰面積為縱坐標（）進行線性回歸，得到木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿的回歸方程分別為＝8 006.3＋178 659，2＝0.999 1；＝9 377.9－151 624，2＝0.999 1；＝50 224－55 478，2＝0.999 9。結果表明，3種成分在相應的質量濃度范圍內與峰面積的線性關系良好。

（2）精密度考察：將入山虎供試品溶液按“2.5.1”項下色譜條件連續進樣6次，計算木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿峰面積的RSD分別為0.43%、0.62%、1.57%，表明儀器精密度良好。

（3）穩定性考察：分別在0、2、4、8、12、24 h將入山虎供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件進樣，計算木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿峰面積的RSD分別為1.86%、0.91%、1.33%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

（4）重復性考察：平行制備6份供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜方法進樣，計算木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿的質量分數RSD分別為2.39%、2.07%、2.62%，表明該方法重復性良好。

（5）加樣回收率考察：取入山虎供試品溶液6份，每份約0.5 g，精密稱定，并精密加入等量的木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿對照品，按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，計算木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿的峰面積，木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿加樣回收率為95.00%～105.00%，RSD分別為2.23%、1.86%、2.16%，表明該方法的準確度良好。

3.5.2 定量結果 將混合對照品和供試品溶液按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，計算木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿的峰面積，HPLC圖譜見圖10。以質量濃度為橫坐標（）、峰面積為縱坐標（）進行線性回歸，得到木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿的回歸方程分別為＝8 006.3＋178 659，2＝0.999 1；＝9 377.9－151 624，2＝0.999 1；＝50 224－55 478，2＝0.999 9。根據回歸方程計算得到木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿的質量分數分別為（2.992 0±0.024 0）、（4.253 2±0.045 9）、（0.965 8±0.001 1）mg/g。橙皮苷含量較高，木蘭花堿、兩面針堿次之。

1-木蘭花堿 2-橙皮苷 3-兩面針堿

4 討論

研究表明，抑制RA成纖維樣滑膜細胞的增生和炎性反應能夠緩解RA的疼痛，同時，有效抑制炎癥因子的分泌對RA治療也具有重要意義[18-19]。而MH7A滑膜纖維細胞是從RA患者的關節滑膜處提取得到，具有類似人RA成纖維樣滑膜細胞的特點[20]，增殖速度較快，可多次傳代，可代替人RA成纖維樣滑膜細胞用于RA的研究。因此，本研究采用入山虎的不同提取部位對MH7A細胞進行干預，考察其增殖活性和炎癥因子的含量。結果顯示，入山虎的氯仿、石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水提取部位組均能夠有效抑制MH7A細胞的增殖，從增殖抑制率上看，正丁醇部位的抑制率較好，氯仿、石油醚、水部位的效果比較接近，水部位次之。

采用TNF-α誘導MH7A細胞后，模型組炎癥因子IL-6、IL-17A、IL-1β含量增加，與文獻報道一致，在炎癥因子刺激下，滑膜成纖維細胞可以分泌其他相關的炎癥因子，如IL-1β、IL-17等[21-25]。還有研究表明，作為致炎因子的IL-1β能夠在RA滑膜組織中大量表達，同時還會誘導其他相關炎癥因子的表達，加重RA的炎癥反應[26-27]。IL-6、IL-17A等炎癥因子能夠促進RA滑膜細胞的增殖、遷移和侵襲，甚至誘導關節軟骨侵蝕[28-30]。在本研究中，入山虎不同提取部位可有效降低TNF-α誘導MH7A細胞分泌的炎癥因子IL-6、IL-17A、IL-1β的含量。

足腫脹程度和關節病理變化是評價抗RA藥物療效的重要指標[31-33]。本研究參照文獻[15-17]中的造模方法，在大鼠的足跖部注射完全弗氏佐劑建立大鼠RA動物模型，造模后大鼠的全身評分≥4、關節炎指數評分≥16，出現前足或后足關節紅腫、踝關節明顯腫脹，嚴重者還會出現拖行現象，與文獻[34-35]報道一致，視為造模成功。因此，本次研究中已成功造模，模型組大鼠的足跖腫脹度及全身評分、關節炎指數顯著升高，且HE染色結果可以看出模型組結締組織增生，有大量的炎性細胞浸潤等現象，而ig給予入山虎的不同提取部位后，均可在不同程度上降低完全弗氏佐劑誘導的RA大鼠的足跖腫脹度、全身評分及關節炎評分，能改善大鼠踝關節組織的病理改變、降低臟器指數。對RA大鼠血清中的炎癥因子進行測定，結果也提示入山虎的不同提取部位具有良好的抗RA作用，均能夠減少炎癥因子IL-6、IL-17A、IL-1β的含量，升高抗炎因子IL-10的含量。其中，在體內實驗中的全身評分、關節炎指數評價中，以氯仿部位的效果相對較好，在RA大鼠血清的抗炎因子IL-10結果中，以氯仿部位的效果相對較好，同時氯仿部位還能升高抗炎因子IL-4的含量。而在體外實驗中，入山虎不同提取物的炎癥因子水平各組間結果相近，無統計學差異，以上結果提示氯仿部位可能是入山虎的抗RA的主要活性部位。

入山虎的化學成分、質量標志物相關研究報道比較少，在一定程度上制約了入山虎的臨床應用與實驗研究。本研究采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS技術對入山虎的正丁醇、醋酸乙酯、氯仿提取物進行化學成分分析，篩選得到化合物69個，初步鑒定結構55個，未知14個。結果可見，入山虎的提取物主要含有生物堿類成分，主要包括呋喃喹啉類、芐基異喹啉類、原小檗堿類、阿樸啡類、苯并菲啶類、酰胺類等生物堿，同時還含有黃酮類、香豆素等其他化合物。本研究未對入山虎總提取物進行抗RA活性研究，而化學成分鑒定可知，入山虎不同提取物均具有結構多樣化的生物堿類成分，這些生物堿類成分可能是入山虎抗RA的活性成分。因此，其總提取物應具有更廣泛的生物堿類成分，更具有一定的抗RA活性作用。而體內外實驗結果提示，入山虎的氯仿部位可能是入山虎抗RA的活性部位，而在化學成分差異分析中，氯仿提取物中的去甲烏藥堿、小檗紅堿、兩面針堿、茵芋堿、白蘚堿、木蘭花堿等一類亞群化合物的含量相對于醋酸乙酯組、正丁醇組較高，與其他2組具有一定的差異，推測這一類亞群的成分可能是導致不同提取物抗RA作用的差異成分。因此，后續應需要繼續對氯仿部位分離、純化、鑒定，進一步研究入山虎抗RA的活性成分。同時本研究還對入山虎的兩面針堿、木蘭花堿、橙皮苷進行定量，可為后續入山虎質量標準的研究提供參考。

綜上，入山虎中的氯仿、石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水部位在體內外對RA均具有良好的抗炎作用，在體外能夠抑制MH7A細胞的增殖，減少炎癥因子IL-6、IL-17A、IL-1β的分泌；在體內對RA大鼠有良好的抗炎作用，還能減少促炎因子IL-6、IL-17A、IL-1β的分泌，增加抗炎因子IL-4、IL-10的分泌，綜合來看以氯仿部位的效果較優，且入山虎的提取部位主要含有生物堿類成分。本研究可為入山虎治療RA的藥效物質基礎提供一定的依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Anti-rheumatoid arthritis activity of different extracts fromvar.

ZENG Ying-gang1, WANG Liu-ping1, 2, 3, FENG Jian-fang1, 2, 3, TANG Dan-dan1, MENG Gan-zhu1

1. Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China 2. Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 3. Guangxi Superior Chinese Patent Medicine and National Medicine Development Engineering Technology Research Center, Nanning 530020, China

To investigate the effect of different extraction parts fromvar.(ZN) on rheumatoid arthritis (RA) and chemical composition analysis of extraction parts.The human RA fibroblast-like synoviocyte cell line MH7A cells were used to investigate the effects of different extraction parts of ZN on the proliferation activity and contents of inflammatory factors. RA rat model was established by intradermal injection of Freund’s complete adjuvant into the toes of rats. The body weight, whole body score, arthritis score, degree of swelling, organ coefficient and contents of inflammatory factor of rats were measured, pathology of ankle joint tissue was used by HE staining to evaluate the anti-RA activity of different extraction parts of ZN. And the chemical constituents of the extract were analyzed by UPLC-Q-TOF-MS/MS.Chloroform, petroleum ether, ethyl acetate,-butanol and water extraction parts of ZN had good anti-inflammatory effects on RAand. ZN could inhibit the proliferation of MH7A cells(< 0.05, 0.01), reduce the secretion of inflammatory factors interleukin-6 (IL-6), IL-17A and IL-1β (< 0.01)., the extraction parts of ZN could reduce the paw swelling, whole body score and arthritis score of RA rats to varying degrees (< 0.05, 0.01), improve the pathological changes of ankle joint, alleviate the inflammatory symptoms of RA rats, reduce the secretion of pro-inflammatory factors IL-6, IL-17A and IL-1β (< 0.01), increase the secretion of anti-inflammatory factors IL-4 and IL-10 (< 0.01). The chemical constituent analysis showed that the extracts of ZN contained similar compounds, including alkaloids, flavonoids, coumarins and other compounds. Most of them were alkaloids, including furan quinolines, benzylisoquinolines, protoberberines, aporphines, benzophenanthridines, amides and so on.Chloroform, petroleum ether, ethyl acetate,-butanol and water extraction parts of ZN have good anti-inflammatory effects on RAand. The extract mainly contains alkaloids, flavonoids, coumarins and other compounds.

(Roxb.) DC. var.Huang;different extraction parts; rheumatoid arthritis; inflammatory factors; alkaloids; flavonoids; coumarins; magnoflorine; hesperidin; nitidine

R285.5

A

0253 - 2670(2023)13 - 4186 - 16

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.012

2023-02-08

國家重點研發計劃項目（2019YFC1712304）；廣西科技基地和人才專項（桂科AD20238058）；廣西壯瑤藥重點實驗室項目（GXZYKF2022-16）；廣西中醫藥管理局科研課題（GXZYZ20210068）

曾英港（1997—），女，壯族，碩士研究生，研究方向為中藥藥劑。Tel: 14777264959 E-mail: zengyinggang2016@163.com

通信作者：王柳萍（1978—），女，壯族，博士，教授，碩士生導師，研究方向為中藥、民族藥的品質與藥效研究。Tel: 18607713396 E-mail: rousel@126.com

奉建芳（1966—），男，瑤族，博士，教授，博士生導師，研究方向為中藥、民族藥制劑研究。Tel: 13817588549 E-mail: fengjianfang@vip.163.com

[責任編輯 李亞楠]