黑柳樹皮化學成分及其抑制脂肪生成活性研究

劉 歡，甲次拉母，蒲沙龍，張吉仲，李麗梅

黑柳樹皮化學成分及其抑制脂肪生成活性研究

劉 歡，甲次拉母，蒲沙龍，張吉仲，李麗梅*

西南民族大學藥學院四川 成都 610041

研究黑柳樹皮的化學成分，并對部分化合物進行抑制脂肪生成活性研究。采用多種色譜分離技術進行分離和純化，并運用核磁共振波譜技術鑒定其結構。以秀麗隱桿線蟲為實驗模型，利用油紅O和蘇丹黑B染色，研究從黑柳樹皮中分離到的部分化合物對秀麗隱桿線蟲脂肪生成的影響。從黑柳樹皮甲醇提取物的正丁醇萃取部位中共分離得到12個化合物，分別鑒定為柳皮苷（1）、特里楊苷（2）、7-水楊酰-2′-苯甲酰水楊苷（3）、cochinchiside A（4）、2′-苯甲酰水楊苷（5）、胡蘿卜苷（6）、rosin（7）、水楊苷（8）、chalcononaringenin-2′--β--glucopyranoside（9）、3,4-二羥基苯甲酸（10）、苯甲酸（11）和水楊酸（12）。其中化合物1、2、5和9能夠顯著抑制秀麗隱桿線蟲脂肪生成。12個化合物均為首次從黑柳中分離得到。化合物5對秀麗隱桿線蟲脂肪生成的抑制作用最強。

黑柳；秀麗隱桿線蟲；抑制脂肪生成活性；柳皮苷；特里楊苷；2′-苯甲酰水楊苷

楊柳科柳屬L. 植物資源豐富，全球約有520種，主要分布于北半球溫帶及寒帶地區，極少數分布在亞熱帶和南半球地區；我國有257種、122變種、33變型，在各省均有分布[1]。其樹皮、枝、葉、花等部位均可入藥，具有悠久的藥用歷史。19世紀40年代，化學家首次從柳樹皮中分離出水楊酸并發現其具有顯著的解熱和鎮痛作用，后來以之為先導化合物誕生了醫藥史上的經典藥物——阿司匹林，至今仍是世界上應用最廣泛的解熱、鎮痛和抗炎藥[2]。后續的研究表明柳屬植物主要含有黃酮類、水楊酸衍生物類、苯丙素類等酚性成分，具有抗腫瘤、鎮痛抗炎、抗氧化、降血糖、調節神經系統等藥理作用[3]。其中酚類成分的減肥作用受到研究者的持續關注，例如Han等[4-5]研究證實旱柳Koidz葉中的多酚組分具有減肥作用；劉可越等[6]發現垂柳L.葉中木犀草素等黃酮類化合物能夠促進去甲腎上腺素分解脂肪，抑制小腸吸收脂肪酸；Lee等[7]從朝鮮垂柳Lévl.樹枝中發現柳皮苷衍生物，該類成分可通過調節C/EBPα和SREBP1c通路，顯著減少脂質積累，抑制前脂肪細胞3T3-L1分化。因此，富含酚類成分的柳屬植物可能是發現減肥藥物的源泉之一。

黑柳Marshall（black willow）別名北美黑柳、沼澤柳、西南黑柳、海灣黑柳、鐮葉柳，原產北美洲，用于治療咳嗽、痢疾、風濕、關節炎和痛風等[8]?，F代藥理學研究表明黑柳醇提物具有抗炎、抗菌活性。Verma等[9]證實黑柳甲醇提取物具有抗炎活性；此外，Sharma等[10]發現黑柳甲醇提取物還可以通過抑制前炎癥因子和氧化壓緩解膠原誘導的關節炎癥狀；Tahir等[11]報道黑柳乙醇提取物具有抗革蘭陽性菌和革蘭陰性菌活性。然而，暫未見黑柳樹皮化學成分及其抑制脂肪生成活性方面的相關報道。因此，本研究采用多種現代色譜和波譜方法對黑柳樹皮化學成分進行分離純化和結構鑒定，并以秀麗隱桿線蟲為實驗模型，利用油紅O和蘇丹黑B染色，探究分離得到的部分化合物抑制脂肪生成活性，以期為黑柳化學成分研究及減肥藥物研發提供參考。從黑柳樹皮70%甲醇提取物中分離鑒定12個化合物，分別為柳皮苷（salicortin，1）、特里楊苷（tremulacin，2）、7-水楊酰-2′-苯甲酰水楊苷（salicyloyltremuloidin，3）、cochinchiside A（4）、2′-苯甲酰水楊苷（tremuloidin，5）、胡蘿卜苷（daucosterol，6）、rosin（7）、水楊苷（salicin，8）、chalcononaringenin-2′-- β--glucopyranoside（9）、3,4-二羥基苯甲酸（3,4- dihydroxybenzoic acid，10）、苯甲酸（benzoic acid，11）和水楊酸（salicylic acid，12）。12個化合物均為首次從黑柳中分離得到；其中化合物1、2、5和9具有顯著抑制秀麗隱桿線蟲脂肪生成的作用，化合物5的作用最強。

1. 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

ME204E型電子天平（德國Mettler Toledo公司）；半制備色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC公司；250 mm×21.2 mm，10 μm，蘇州納微生物科技有限公司）；LC-P100型高效液相色譜儀（上海伍豐科學儀器有限公司）；AVANCE III-400型核磁共振儀（德國Bruker公司）；Leica DM750型顯微鏡（德國Leica公司）；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安公司）；DH-600型電熱恒溫培養箱（北京中興偉業儀器有限公司）；ZHWY-211B、ZHWY-2102C型恒溫培養震蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司）；H1650-W型離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）。

柱色譜硅膠（80～100、200～300目）、薄層硅膠板GF254（青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20（GE Healthcare Bio-Sciences AB）；反相硅膠（蘇州納微生物科技有限公司）；油紅O和蘇丹黑B（美國阿拉丁工業公司）；其余試劑均為國產分析純。奧利司他（浙江海正藥業股份有限公司；規格：0.12 g/片）。

1.2 材料

黑柳樹皮藥材購于成都健騰生物技術有限公司，由西南民族大學藥學院任艷副教授鑒定為楊柳科柳屬植物黑柳Marshall的干燥樹皮，標本保存在藥學院中藥標本室；秀麗隱桿線蟲和大腸桿菌OP50（OP50）來源于中國科學院成都生物研究所應用與環境微生物中心。

2. 方法

2.1 提取與分離

取干燥的黑柳樹皮藥材20 kg，粉碎后，用70%甲醇-水提取3次，濾過，濃縮，隨后加水使其成懸濁液，用正丁醇萃取得總浸膏（100.5 g）?？偨嘤眉兯芙夂螅M行反相柱色譜，分別以40%甲醇-水和60%甲醇-水進行洗脫，得40%甲醇-水（A，10.5 g）、60%甲醇-水（B，15.3 g）2個組分。

40%甲醇-水組分（A，10.5 g），用正相硅膠柱色譜（200～300目）分離，以二氯乙烷-丙酮（25∶1、15∶1、10∶1、5∶1、3∶1）洗脫，共得5個組分A1～A5?；衔?（3 mg）從A2（8 mg）的甲醇溶液中以白色松軟固體析出；A3（3 g）經半制備液相色譜（12%乙腈-水，30 mL/min）分離得到化合物8（1.1 g，R＝6 min）和10（15 mg，R＝24 min）；A4（1.2 g）進行Sephadex LH-20柱色譜，以二氯乙烷-甲醇（1∶1）洗脫，分得3個組分A3-1～A3-3，其中A3-3（300 mg）經半制備液相色譜分離（15 mL/min），得化合物9（22 mg，R＝16 min）；A5（3 g）用正相硅膠柱色譜（200～300目）分離，以石油醚-丙酮（2∶1）混合溶劑洗脫，得A5-1（2.4 g），A5-1經半制備液相色譜（22%乙腈-水，30 mL/min）分離得到A5-1-1（0.65 g，R＝9.5 min）和化合物7（9 mg，R＝13 min），A5-1-1再進行Sephadex LH-20柱色譜，以甲醇-水（1∶1）洗脫，得到化合物1（0.61 g）。

60%甲醇-水組分（B，15.3 g），經半制備液相色譜（60%甲醇-水，50 mL/min）分離得到6個組分B1～B6。B1（2.2 g）經半制備液相色譜（30%乙腈-水，30 mL/min）分離得B1-1（1 g，R＝5 min），B1-1用正相硅膠柱色譜（200～300目）分離，依次以二氯乙烷-丙酮（10∶1、3∶1）洗脫，得化合物11（12 mg）、4（61.6 mg）和5（130 mg）；B6（2.9 g）用正相硅膠柱色譜（200～300目）分離，分別以二氯乙烷-丙酮（25∶1、15∶1、3∶1）混合溶劑洗脫，得B6-1～B6-3，其中B6-1的甲醇溶液中析出化合物12（1.7 g），B6-2進行Sephadex LH-20柱色譜，以甲醇-水（1∶1）為溶劑洗脫，分離得到化合物2（0.69 g）和3（8 mg）。

2.2 抑制脂肪生成活性篩選

2.2.1的培養與同期化 將接種于長滿OP50的線蟲生長培養基（nematode growth medium，NGM）上，于18.5 ℃的恒溫培養箱中培養3～5 d，約3 d轉板1次，防止線蟲過老或處于饑餓抑制狀態，同時要保證線蟲干凈[12]。培養完成后，選取50～70條用700 μL M9緩沖液沖洗轉移至1.5 mL EP管中，離心后棄去上清液。用M9緩沖液定容至500 μL，加入等體積的現配裂解液，再次離心棄去上清液。加入M9緩沖液，孵化12 h，得L1期的。離心后，沉淀轉入含有OP50的NGM培養基上培養48～72 h，即可得到L4期的。

2.2.2 加樣培養 預實驗結果顯示化合物質量濃度為50 μg/mL時抑制體內脂肪生成的作用較強。因此，設置樣品質量濃度為50 μg/mL以測定其對脂肪生成抑制活性。吸取等量配制好的樣品溶液和活化后的OP50于EP管中混合均勻，均勻涂布于NGM培養基上，置于恒溫培養箱（37 ℃）中，培養18 h，待NGM培養基上長滿OP50后，將同期化至L1期的轉移到該培養基上（為了方便區分，只接種于NGM培養基的半邊），于恒溫培養箱（18.5 ℃）培養3～5 d即可進行后續實驗。觀察樣品對脂肪生成的影響，陽性對照和陰性對照分別為奧利司他和DMSO。

2.2.3 油紅O染色 給藥3～5 d后，挑選出50條至EP管中，在室溫下，加入500 μL 4%多聚甲醛固定，30 min后，迅速轉移至?80 ℃的冷凍箱內冷藏15 min，緊接著快速置于水浴鍋（43 ℃）中使之融化，其后加入700 μL M9緩沖液清洗，并于1500 r/min離心3 min后棄去上清液，重復清洗操作3次。加入油紅O染液染色12 h后，用PBS緩沖液清洗3次，置于顯微鏡下觀察、拍照[13]。

2.2.4 蘇丹黑B染色 給藥3～5 d后，挑選出50條至EP管中，在室溫下，加入500 μL 4%多聚甲醛固定，30 min后，離心棄去上清液，并依次用25%甲醇溶液、50%甲醇溶液和70%甲醇溶液（500 μL）對進行脫水處理（8～10 min），每次脫水結束后，置于1500 r/min離心機中離心3 min，棄去上清液。脫水處理后用蘇丹黑B染液染色，浸潤，待過夜后用70%乙醇沖洗，然后再加入M9緩沖液沖洗3次，置于顯微鏡下觀察、拍照[14]。

3 結果

3.1 結構鑒定

化合物1：白色無定形吸濕性粉末，易溶于甲醇。分子式C20H24O10。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.32 (1H, m, H-5), 7.30 (1H, d,= 7.52 Hz, H-3), 7.20 (1H, d,= 8.1 Hz, H-6), 7.01 (1H, t,= 7.4 Hz, H-4), 6.14 (1H, dt,= 9.7, 3.8 Hz, H-11), 5.75 (1H, dt,= 9.8, 1.6 Hz, H-10), 5.37, 5.26 (各1H, d,= 12.4 Hz, H-7), 4.92 (1H, d,= 7.5 Hz, H-1′), 3.88 (1H, dd,= 12.0, 1.8 Hz, H-6a′), 3.69 (1H, dd,= 12.0, 5.2 Hz, H-6b′), 3.37～3.47 (4H, m, H-2′～5′), 2.89 (1H, m, H-13a), 2.71～2.60 (3H, m, H-12, 13b)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 207.5 (C-14), 171.4 (C-8), 157.0 (C-1), 133.2 (C-10), 131.1 (C-5), 130.7 (C-11), 129.4 (C-3), 125.9 (C-6), 123.4 (C-4), 117.0 (C-2), 102.3 (C-1′), 79.5 (C-9), 78.1 (C-3′), 78.0 (C-5′), 74.9 (C-2′), 71.2 (C-4′), 64.4 (C-7), 62.5 (C-6′), 36.8 (C-13), 27.2 (C-12)。上述數據與文獻報基本一致[15-16]，故鑒定化合物1為柳皮苷。

化合物2：白色無定形粉末，易溶于氯仿。分子式C27H28O11。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.00 (2H, d,= 7.3 Hz, H-3′′′, 7′′′), 7.51 (1H, t,= 7.4 Hz, H-5′′′), 7.36 (2H, t,= 7.7 Hz, H-4′′′, 6′′′), 7.24 (1H, td,= 7.9, 1.4 Hz, H-5), 7.16 (1H, dd,= 7.5, 1.0 Hz, H-3), 7.02 (1H, d,= 8.2 Hz, H-6), 6.98 (1H, t,= 7.5 Hz, H-4), 6.03 (1H, dt,= 9.6, 3.7 Hz, H-3′), 5.69 (1H, d,= 9.8 Hz, H-2′), 5.32 (1H, t,= 8.5 Hz, H-2′′), 5.15 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1′′), 5.09, 4.95 (各1H, d,= 12.5 Hz, H-7a, 7b), 3.90 (3H, m, H-3′′～6′′), 3.52 (1H, m, H-5′′), 2.94 (1H, dt,= 14.7, 8.0 Hz, H-5′), 2.39～2.66 (3H, m, H-5′, 4′)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 207.6 (C-6′), 170.0 (C-7′), 166.2 (C-1″′), 156.1 (C-1), 133.5 (C-5″′), 132.1 (C-3′), 130.0 (C-5), 129.9 (C-3″′, 7″′), 129.6 (C-2″′), 129.5 (C-3), 128.7 (C-4″′, 6″′), 127.6 (C-2), 127.4 (C-2′), 123.2 (C-4), 115.7 (C-6), 99.7 (C-1″), 78.3 (C-1′), 76.1 (C-5″), 75.0 (C-3″), 74.0 (C-2″), 70.1 (C-4″), 63.5 (C-7), 60.9 (C-6″), 35.4 (C-5′), 26.7 (C-4′)。上述數據與文獻報道基本一致[17]，故鑒定化合物2為特里楊苷。

化合物3：白色無定形粉末，微溶于甲醇。分子式C27H26O10。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 10.43 (1H, s, 10-OH), 7.93 (2H, d,= 7.3 Hz, H-2′′, 6′′), 7.41～7.55 (3H, m, H-12, 14, 4′′), 7.40 (2H, t,= 7.8 Hz, H-3′′, 5′′), 7.35 (2H, m, H-3, 5), 7.25 (1H, d,= 8.2 Hz, H-6), 7.04 (1H, t,= 7.4 Hz, H-4), 6.95 (1H, d,= 8.3 Hz, H-11), 6.80 (1H, t,= 7.5 Hz, H-13), 5.51 (1H, d,= 5.8 Hz, 3′-OH), 5.33～5.41 (2H, m, 4′-OH, H-1′), 5.12 (2H, s, H-7), 5.05～5.11 (1H, m, H-2′), 4.74 (1H, t,= 5.5 Hz, 6′-OH), 3.78 (1H, dd,= 9.8, 5.3 Hz, H-6′), 3.71 (1H, td,= 9.2, 5.9 Hz, H-3′), 3.51～3.59 (2H, m, H-5′, 6′), 3.35 (1H, m, H-4′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 168.7 (C-8), 165.2 (C-7″), 160.4 (C-10), 155.0 (C-1), 135.7 (C-12), 133.0 (C-4″), 130.1 (C-3, 5), 129.7 (C-14), 129.5 (C-1″), 129.3 (C-2″, 6″), 128.5 (C-3″, 5″), 124.0 (C-2), 122.2 (C-4), 119.5 (C-11), 117.3 (C-13), 115.0 (C-6), 112.7 (C-9), 98.5 (C-1′), 77.5 (C-5′), 74.3 (C-2′), 74.0 (C-3′), 70.1 (C4′), 61.7 (C-7), 60.2 (C-6′)。上述數據與文獻報道基本一致[18]，故鑒定化合物3為7-水楊酰-2′-苯甲酰水楊苷。

化合物4：淺黃色無定形粉末，微溶于甲醇。分子式C27H28O11。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 7.95 (2H, dd,= 8.2, 1.2 Hz, H-2′′′, 6′′′), 7.58 (1H, t,= 7.4 Hz, H-4′′′), 7.46 (2H, t,= 7.8 Hz, H-3′′′, 5′′′), 7.24 (1H, t,= 6.8 Hz, H-5), 7.17 (1H, dd,= 7.6, 1.3 Hz, H-3), 7.12 (1H, d,= 8.1 Hz, H-6), 6.96 (1H, t,= 7.3 Hz, H-4), 6.03 (1H, dt,= 9.8, 3.8 Hz, H-3′′), 5.66 (1H, dt,= 9.8, 1.8 Hz, H-2′′), 5.18 (1H, d,= 13.1 Hz, H-7a), 5.14～5.07 (2H, m, H-7b, 3′), 5.02 (1H, d,= 7.7 Hz, H-1′), 3.45～3.65 (5H, m, H-2′, 4′～6′), 2.46～2.64 (4H, m, H-4′′, 5′′)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 206.1 (C-6′′), 170.1 (C-7′′), 165.4 (C-7′′′), 154.7 (C-1), 133.1 (C-4′′′), 131.7 (C-3′′), 130.4 (C-5), 129.5 (C-3, 2′′′, 6′′′), 128.8 (C-1′′′), 128.6 (C-3′′′, 5′′′), 128.4 (C-2′′), 124.6 (C-2), 122.1 (C-4), 115.1 (C-6), 100.4 (C-1′), 78.5 (C-1′′), 77.4 (C-5′), 76.7 (C-3′), 71.5 (C-2′), 67.6 (C-4′), 62.2 (C-7), 60.4 (C-6′), 35.7 (C-5′′), 26.0 (C-4′′)。上述數據與文獻報道基本一致[19]，故鑒定化合物4為cochinchiside A。

化合物5：白色粉末，微溶于甲醇。分子式C20H22O8。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.99 (2H, d,= 7.5 Hz, H-2′′, 6′′), 7.65 (1H, t,= 7.3 Hz, H-4′′), 7.52 (2H, t,= 7.7 Hz, H-3′′, 5′′), 7.30 (1H, d,= 7.4 Hz, H-3), 7.17 (1H, t,= 7.5 Hz, H-5), 7.08 (1H, d,= 8.1 Hz, H-6), 6.98 (1H, t,= 7.4 Hz, H-4), 5.49 (1H, d,= 5.7 Hz, 3′-OH), 5.34 (1H, d,= 5.4 Hz, 4′-OH), 5.24 (1H, d,= 8.0 Hz, H-1′), 5.06 (1H, t,= 8.8 Hz, H-2′), 4.89 (1H, t,= 5.6 Hz, 7-OH), 4.71 (1H, t,= 5.3 Hz, 6′-OH), 4.38, 4.11 (各1H, dd,= 15.1, 5.5 Hz, H-7), 3.76 (1H, dd,= 10.3, 5.1 Hz, H-6′), 3.65～3.72 (1H, m, H-3′), 3.49～3.57 (3H, m, H-6′～4′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 165.5 (C-7′′), 153.8 (C-1), 133.8 (C-4′′), 131.6 (C-2), 130.3 (C-1′′), 129.8 (C-2′′, 6′′), 129.2 (C-3′′, 5′′), 127.8 (C-5), 126.8 (C-3), 122.4 (C-4), 114.4 (C-6), 98.7 (C-1′), 77.7 (C-5′), 74.7 (C-2′), 74.3 (C-3′), 70.4 (C-4′), 61.0 (C-6′), 57.7 (C-7)。上述數據與文獻報道基本一致[18]，故鑒定化合物5為2′-苯甲酰水楊苷。

化合物6：白色固體，微溶于甲醇。分子式C35H60O6。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 5.32 (1H, brs, H-6), 4.87 (3H, m, OH), 4.43 (1H, t,= 5.7 Hz, H-3), 4.20 (1H, d,= 7.7 Hz, H-1′), 2.88～3.63 (m, 5H of glucose), 0.94 (3H, s, H-19), 0.89 (3H, d,= 6.3 Hz, H-21), 0.80 (9H, overlapped, H-26, 27, 29), 0.64 (3H, s, H-18)。上述數據與文獻報道基本一致[20]，且與胡蘿卜苷對照品對照，多種展開體系下TLC的Rf值一致，故鑒定化合物6為胡蘿卜苷。

化合物7：白色無定形粉末，易溶于甲醇。分子式C15H20O6。1H NMR (400 MHz, CD3OD): 7.40 (2H, d,= 7.3 Hz, H-2, 6), 7.28 (2H, t,= 7.5 Hz, H-3, 5), 7.20 (1H, m, H-4), 6.67 (1H, d,= 16.0 Hz, H-7), 6.36 (1H, dt,= 16.0, 6.1 Hz, H-8), 4.52 (1H, ddd,= 12.8, 5.6, 1.3 Hz, H-9a), 4.35 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1′), 4.31 (1H, ddd,= 12.9, 9.6, 1.1 Hz, H-9b), 3.87 (1H, d,= 11.9 Hz, H-6a′), 3.66 (1H, dd,= 11.9, 5.4 Hz, H-6b′), 3.20～3.37 (4H, overlapped, H-2′～5′)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 136.8 (C-1), 132.4 (C-7), 128.2 (C-3, 5), 127.3 (C-4), 126.1 (C-2, 6), 125.3 (C-8), 101.9 (C-1′), 76.7 (C-3′), 76.6 (C-5′), 73.7 (C-2′), 70.3 (C-4′), 69.3 (C-9), 61.4 (C-6′)。上述數據與文獻報道基本一致[21]，故鑒定化合物7為rosin。

化合物8：白色針狀結晶（甲醇），易溶于甲醇。分子式C13H18O7。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.36 (1H, d,= 7.3 Hz, H-3), 7.19 (1H, t,= 7.2 Hz, H-5), 7.09 (1H, d,= 8.0 Hz, H-6), 7.00 (1H, t,= 7.3 Hz, H-4), 5.35 (1H, d,= 4.0 Hz, 4′-OH), 5.09 (1H, d,= 3.4 Hz, 3′-OH), 5.03 (1H, d,= 5.2 Hz, 2′-OH), 4.99 (1H, t,= 5.9 Hz, 7-OH), 4.76 (1H, d,= 7.2 Hz, H-1′), 4.64 (1H, dd,= 14.3, 5.5 Hz, H-7a), 4.59 (1H, t,= 5.7 Hz, 6′-OH), 4.46 (1H, dd,= 14.3, 6.2 Hz, H-7b), 3.74～3.66 (1H, m, H-6a′), 3.47 (1H, dt,= 11.8, 6.0 Hz, H-6b′), 3.33～3.16 (4H, m, H-2′～5′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 155.1 (C-1), 132.4 (C-2), 128.1 (C-5), 127.7 (C-3), 122.5 (C-4), 115.4 (C-6), 101.6 (C-1′), 82.9 (C-5′), 82.3 (C-3′), 73.7 (C-2′), 70.0 (C-4′), 61.0 (C-6′), 58.8 (C-7)。上述數據與文獻報道基本一致[22]，故鑒定化合物8為水楊苷。

化合物9：黃色針狀結晶（甲醇），易溶于甲醇。分子式C20H22O8。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.99 (1H, d,= 15.5 Hz, H-α), 7.64 (2H, d,= 8.4 Hz, H-2, 6), 7.60 (1H, d,= 15.6 Hz, H-β), 6.82 (2H, d,= 8.2 Hz, H-3, 5), 6.15 (1H, brs, H-5′), 5.94 (1H, brs, H-3′), 5.07 (1H, d,= 7.3 Hz, H-1′′), 3.23～3.71 (6H, m, of glucose)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6)191.9 (C＝O), 166.1 (C-2′), 164.8 (C-4′), 160.4 (C-4), 160.0 (C-6′), 142.7 (C-β), 130.8 (C-2, 6), 126.3 (C-1), 124.3 (C-α), 116.02 (C-3, 5), 105.3 (C-1′), 100.4 (C-1′′), 97.1 (C-3′), 94.9 (C-5′), 77.4 (C-5′′), 76.8 (C-3′′), 73.7 (C-2′′), 69.5 (C-4′′), 60.5 (C-6′′)。上述數據與文獻基本一致[23]，故鑒定化合物9為chalcononaringenin-2′--β--glucopyranoside。

化合物10：白色粉末，易溶于甲醇。分子式C7H6O4。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.46 (1H, d,= 2.1 Hz, H-2), 7.43 (1H, dd,= 7.9, 2.1 Hz, H-6), 6.82 (1H, d,= 7.9 Hz, H-5)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 170.3 (C-7), 151.5 (C-4), 146.0 (C-3), 123.9 (C-1), 123.0 (C-6), 117.7 (C-2), 115.7 (C-5)。上述數據與文獻報道基本一致[24]，故鑒定化合物10為3,4-二羥基苯甲酸。

化合物11：白色粉末，易溶于甲醇。分子式C7H6O2。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.12 (2H, m, H-2, 6), 7.59 (1H, m, H-4), 7.46 (2H, m, H-3, 5)；13C- NMR (100 MHz, CDCl3): 172.4 (C-7), 134.0 (C-4), 130.5 (C-2, 6), 129.5 (C-1), 128.5 (C-3, 5)。上述數據與文獻報道基本一致[25]，故鑒定化合物11為苯甲酸。

化合物12：白色針狀結晶（甲醇），mp 160～161 ℃。在3種展開體系中TLC行為與水楊酸對照品一致，且混合熔點不下降。故鑒定為水楊酸。

3.2 抑制脂肪生成活性篩選結果

由于苯乙醇苷類化合物是從黑柳樹皮中分離得到的主要成分，所以本研究選擇3個代表性化合物即柳皮苷（1）、特里楊苷（2）和2′-苯甲酰水楊苷（5）進行抑制脂肪生成活性篩選，同時也選擇了黃酮類化合物chalcononaringenin-2′--β-- glucopyranoside（9），以對比2類化合物的抑制脂肪生成活性，為后續研究提供參考。

3.2.1 油紅O染色結果 油紅O染色結果如圖1所示，脂肪率根據脂肪顆粒占線蟲整體體積的比例確定。實驗樣品作用于后，與陰性對照組比較（脂肪率為42.05%），體內被染色部分明顯減少，線蟲體內脂肪率分別降低為柳皮苷11.77%、特里楊苷25.23%、2′-苯甲酰水楊苷11.35%和chalcononaringenin-2′--β--glucopyranoside 15.98%，說明4個化合物對體內脂肪生成均有明顯的抑制作用，其中化合物1、5和9的活性強于陽性對照（脂肪率為21.57%）。

3.2.2 蘇丹黑B染色結果 蘇丹黑B對染色結果如圖2所示，與陰性對照組相比較（脂肪率為26.70%），可看到體內被染成黑色的脂肪顆粒明顯減少，線蟲體內脂肪率分別降低為柳皮苷13.35%、特里楊苷14.15%、2′-苯甲酰水楊苷10.15%和chalcononaringenin-2′--β--gluco- pyranoside 11.75%，這表明4個化合物對體內脂肪生成均有明顯的抑制作用，且強于陽性對照（脂肪率為14.46%）。

4 討論

本研究從黑柳樹皮中分離鑒定了12個化學成分，包括6個水楊苷類化合物（化合物1～5和8）、1個查耳酮類化合物（化合物9）、1個甾體皂苷類化合物（化合物6）、1個苯丙烯醇苷類化合物（化合物7）和3個苯甲酸衍生物（10～12），所有化合物均為首次從黑柳中分離得到。選擇其中4個化合物進行了線蟲體內抑制脂肪生成活性研究，油紅O和蘇丹黑B 2種染色結果都顯示，4個化合物樣品具有較好的抑制脂肪生成的作用，其中2′-苯甲酰水楊苷（5）在2種染色實驗中均呈現最強的抑制活性。

圖1 化合物1、2、5、9抑制C. elegans體內脂肪生成的油紅O染色結果

圖2 化合物1、2、5、9抑制C. elegans體內脂質累積的蘇丹黑B染色結果

此外，通過對實驗結果的觀察，發現油紅O能將脂肪染成滴狀，易觀察，而蘇丹黑B很難將脂肪染成滴狀或顆粒，通常呈現為黑色堆積，但是蘇丹黑B能夠將內脂肪顯示的更完整。因此，結合2種染色方法，才能夠更好地觀察體內脂肪的分布和數量。

本研究首次報道了黑柳樹皮提取物的化學成分，并探究了部分化合物對脂肪生成的影響，為從該植物中發現具有抑制脂肪生成作用的化合物提供了一定的參考，并為黑柳植物的開發與應用提供科學基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chemical constituents from barks ofand its anti-adipogenic activity

LIU Huan, JIACI Lamu, PU Sha-long, ZHANG Ji-zhong, LI Li-mei

College of Pharmacy, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China

To study the chemical composition from the barks ofMarshall and its anti-adipogenic activity.The chemical constituents from the barks ofwere isolated by chromatographic methods and the structures of the isolated compounds were elucidated on the basis of NMR spectroscopic analyses. The anti-adipogenic activity of some compounds was evaluated inby oil red O and Sudan black B staining methods.A total of 12 compounds were isolated from barks ofand identified as salicortin (1), tremulacin (2), salicyloyltremuloidin (3), cochinchiside A (4), tremuloidin (5), daucosterol (6), rosin (7), salicin (8), chalcononaringenin-2′--β--glucopyranoside (9), 3,4-dihydroxybenzoic acid (10), benzoic acid (11), and salicylic acid (12), respectively. Among them, compounds 1, 2, 5 and 9 could significantly reduce adipose accumulation in.All twelve compounds were isolated fromfor the first time. Compound 5 exhibited the strongest effect to reduce adipose accumulation in

Marshall;; anti-adipogenic activity; salicortin; tremulacin; tremuloidin

R284.1

A

0253 - 2670(2023)13 - 4111 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.004

2023-01-09

大學生創新創業訓練計劃項目（S202210656135）

劉 歡，本科生。E-mail: 1115935565@qq.com

通信作者：李麗梅，教授，研究方向為中藥與民族藥研究與開發。E-mail: limeili@swun.edu.cn

[責任編輯 王文倩]