宏基因二代測序在肺部感染病原菌檢測的應用

劉 靜,閆莉莉,趙淑賢,王 永,郜玉峰,李家斌,王保貴

肺部感染臨床十分常見,病原體種類繁多,可導致多種并發癥,是全世界感染性疾病死亡的主要原因[1]。因此,準確識別感染的病原體并進行針對性治療尤為重要,目前微生物檢測的方法有常規微生物培養、基于聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)的核酸檢測等[2-3]。仍有近一半肺部感染患者的病原學診斷尚不清楚[4]。因此,迫切需要具有更高診斷效率的病原體檢測和鑒定方法,以克服敏感性、特異性、檢測周期和診斷譜的局限性。

宏基因二代測序(metagenomics next-generation sequencing,mNGS)是一種直接利用患者標本進行泛核酸檢測,提取樣本中的所有核酸并測序,以獲得宿主和微生物的序列,并通過特定生物信息分析軟件包來鑒定病原體的方法[5]。目前,mNGS在臨床病原學的檢測中得到廣泛應用。該研究回顧性選取臨床疑似肺部感染患者為研究對象,旨在評價mNGS檢測技術在病原學檢查診斷中的效能及與傳統檢測方法之間的效能差異。

1 材料與方法

1.1 病例資料研究對象為2020年1月—2022年6月在阜陽市人民醫院、阜陽市第五人民醫院、安徽醫科大學第一附屬醫院收治的疑似肺部感染患者161例,并對患者的病歷進行審查,以收集基線信息,包括年齡、性別、是否合并基礎疾病、臨床表現、入院前抗生素使用情況、全血細胞計數、C反應蛋白(CRP)和降鈣素原(PCT)水平、常規培養和呼吸道病原體核酸檢測結果。

1.2 主要試劑與儀器瓊脂培養基(濟南百博生物技術股份有限公司);病原菌核酸檢測試劑盒、恒溫核酸擴增微流控芯片核酸分析儀(成都博奧晶芯生物科技有限公司);Agilent2100 生物分析儀(美國Agilent Technologies公司)。

1.3 納入、排除標準和診斷依據

1.3.1納入標準 ① 年齡不小于14周歲;② 經胸部CT檢查有肺部陰影,無法排除肺部感染診斷;③ 臨床癥狀包括咳嗽、咳痰、發熱等;④ 送檢樣本符合mNGS檢測要求;⑤ 可在入院或發病后24 h內收集痰,或病情允許下48 h內的可獲得的不同標本,包括:BALF、肺組織活檢標本、胸水、血液;⑥ 簽署知情同意書。

1.3.2排除標準 ① 合并嚴重精神疾患;② 伴意識障礙;③ 拒絕配合研究;④ 合并心、肝、腎等器官功能不全;⑤ 標本污染;⑥ 臨床信息不全。

1.3.3診斷依據 肺部感染臨床診斷標準(確診標準)。(1)肺炎相關臨床表現:① 新近出現的咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病癥狀加重,伴或不伴膿痰、胸痛、呼吸困難及咯血;② 發熱;③ 肺實變體征和(或)聞及濕性啰音;④ 外周血白細胞計數>10×109/L或<4×109/L,伴或不伴細胞核左移。(2)胸部影像學檢查顯示,新出現的斑片狀浸潤影、葉或段實變影、磨玻璃影或間質性改變,伴或不伴胸腔積液。符合(1)中任何一項及第(2)項[6]。

非肺部感染入選標準。入院后積極完善相關檢查,經臨床明確診斷為其他肺部疾病如肺惡性腫瘤、肺結節病等。

1.3.4倫理學 納入研究的所有患者簽署知情同意書,并通過阜陽市人民醫院倫理委員會批準,倫理批號:[2021]38號。

1.4 標本采集根據患者病情收集入院或發病后24 h內的痰液,或病情允許下48 h內的可獲得的不同標本,包括:BALF、肺組織活檢標本、胸水、血液;按標準采集流程操作。將每種類型標本同時進行常規培養、呼吸道病原體核酸檢測及病原微生物mNGS檢測。

1.5 方法

1.5.1常規培養 采用瓊脂培養基對送檢標本進行培養及藥敏試驗分析,首先將瓊脂培養基進行復溫,溫度接種前接近室溫,然后將采集的標本劃線接種或涂布平板,最后將培養基放置培養箱培養,最后根據美國臨床實驗室標準協會2019年規定的標準進行培養結果判讀。

1.5.2呼吸道病原體核酸檢測 采用呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒(恒溫核酸擴增芯片法)及恒溫核酸擴增微流控芯片核酸分析儀對13種常見下呼吸道病原菌的核酸一步完成定性檢測,包括肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、嗜肺軍團菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎支原體、衣原體、結核分枝桿菌復合群。病毒類PCR未納入該項研究中。按照試劑盒說明書進行核酸提取、加樣、檢測,之后進行結果判讀。

1.5.3mNGS實驗 將無菌密封的標本破壁離心后,取600 μl上清液,并使用DNA提取試劑盒提取DNA。并經超生破碎至200～300 bp大小的片段后,進行DNA末端修復、接頭連接和PCR 擴增。使用Agilent2100 生物分析儀和Qubit分別對DNA文庫片段大小及濃度進行質控。在相關平臺進行mNGS,將得到的原始數據進行生物信息學數據處理。

生物信息學分析:原始測序數據需剔除接頭序列、低質量、短讀長序列以及人源序列。將獲得的高質量測序數據與微生物基因組數據庫進行比對,進而鑒定微生物。

mNGS結果解釋的閾值標準 SMRN:在物種水平上嚴格序列數。對于不同類型的微生物,閾值設置如下:細菌、病毒、真菌、支原體、衣原體SMRN>3,寄生蟲SMRN ≥100,結核分枝桿菌SMRN≥1。肺部感染致病的病原體:不包括口腔、呼吸道或皮膚的正常菌群(通過大量文獻檢索)。滿足3位經驗豐富的資深臨床醫師的臨床判斷。通過mNGS檢測到的符合所有標準的微生物被鑒定為疑似病原體。

1.5.4觀察指標 采用臨床診斷結果為金標準,計算常規培養、呼吸道病原體核酸檢測及病原微生物mNGS檢測診斷肺部感染的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值。

2 結果

2.1 人口資料及患者特征161例患者中,年齡16～86(64.13±14.75)歲;其中男性99例,女性62例。入院前癥狀:發熱106例,咳嗽156例,咳痰148例,呼吸困難15例。其中,83例(83/161,51.55%)患者合并基礎疾病。在所有患者中,獲取標本類型最多的是BALF,占所有患者的68.32%,其余依次為痰、肺組織、血液及胸腔積液(表1)。

2.2 肺部感染患者的臨床特征161例患者中有113例確診為肺部感染,具體臨床特征見表2。

表2 肺部感染患者臨床特征(n=113)

2.3 3種檢測方法診斷性能比較及與臨床診斷結果一致性在161例患者中,常規培養、呼吸道病原體核酸檢測、mNGS診斷肺部感染的陽性率依次為9.94%(16/161)、21.12%(34/161)、60.87%(98/161)(表3)。mNGS檢測肺部感染病原菌相對常規培養和呼吸道病原體核酸檢測法,其靈敏度、陰性預測值差異有統計學意義(P<0.001);mNGS相對常規培養,其特異度差異有統計學意義(P<0.05),相對呼吸道病原體核酸檢測差異無統計學意義;mNGS相對常規培養,其陽性預測值差異無統計學意義,相對呼吸道病原體核酸檢測差異有統計學意義(P=0.001)(表 4)。

表3 3種檢測方法與臨床診斷結果一致性比較

表4 mNGS相比常規培養和呼吸道病原體核酸檢測在肺部感染中的診斷性能

2.4 3種方法檢出病原學種類綜合所有標本檢測結果,mNGS檢出細菌數目高于其余2種方法,特別是在分枝桿菌、衣原體、放線菌的檢測具有明顯優勢。但是對于銅綠假單胞菌的檢測不及常規培養和呼吸道病原體核酸檢測。mNGS在曲霉屬真菌及病毒的檢測具有明顯優勢,這些病原體在其余2中檢測方法中均未能檢出(圖1)。此外,在所有檢測陽性的標本中,檢出2種及其以上病原體占比57.14%。

圖1 常規培養、呼吸道病原體核酸檢測、mNGS 3種方法在BALF、痰、肺組織、血液和胸腔積液中檢出不同病原體的患者例數

3 討論

肺部感染臨床常見的致病微生物為細菌、真菌、病毒、支原體、衣原體等,可單獨或聯合導致感染,在住院患者中常因病原菌無法明確,致使治療延誤,甚至增加了疾病的復發率及病死率。而快速準確地檢測病原體、精準使用抗菌藥物、減少耐藥菌的發生等一系列急需解決的醫療難題一直是感染性疾病領域的一大挑戰。

由于病原菌常規培養流程過于復雜、耗時較長,同時由于廣譜抗生素不合理應用,培養的陽性率降低。該研究采用的常規培養鑒定病原微生物雖然同樣體現較高的特異度,但敏感度較低,因此急需新型的檢測手段提高病原菌檢測。

呼吸道病原體核酸檢測利用恒溫核酸擴增芯片法進行[7],整個檢測過程可以在15～60 min內完成[8]。該組研究數據顯示,呼吸道病原體核酸檢測的靈敏度遠高于常規培養法,但特異度低于常規培養。此外,其恒溫核酸擴增芯片法操作簡便、結果獲取快速[9],具備快速診斷呼吸道感染性疾病的能力。在檢測下呼吸道感染病原體中應用,遠優于常規培養。但呼吸道病原體核酸檢測僅能對已知的病原體如金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等進行檢測,可能遺漏少見病原體、真菌、病毒等微生物,這降低了檢測[10]的敏感性。

mNGS是一種快速、客觀、全面、準確的病原微生物分子診斷方法。與以上介紹的2種診斷技術相比,mNGS無需預設、無需培養、無偏倚采樣分析,建庫過程中系直接對整個檢測標本進行核酸測序,無需對樣本進行擴增,可廣泛鑒定已知、潛在、常規難以檢測甚至發現新的病原體[11]。在同時檢測細菌、真菌和病毒方面具有明顯優勢。該研究顯示,mNGS檢測的病原學種類較常規培養及呼吸道病原體核酸檢測明顯更多,除常見的呼吸道常見致病菌外,也能檢出少見病原菌,如隱球菌、奴卡菌、細小病毒、鸚鵡熱衣原體、鳥-胞內分支桿菌復合群等,提高了病原學檢出的陽性率,利于指導臨床抗生素的使用。mNGS的另一個優點是可以鑒定菌株種類和耐藥[12]預測,提供必要的輔助基因組信息。mNGS可以通過測序reads的計數來提供關于樣本中生物體濃度的定量或半定量數據,這對多微生物樣本或在疾病過程[13]中涉及多個病原體的情況下很有用。

在該院收治的感染性疾病中,肺部感染約占40%,但大部分患者缺乏精準的病原學診斷,這與入院前接受廣譜抗生素的應用、標本獲取不當、常規檢測或已有的實驗室檢測方法無法獲取病原菌等多種因素有關。然而,mNGS作為一種新型的檢測手段,具有較高的靈敏度及特異度,目前已被廣泛應用于臨床病原學診斷。該研究數據顯示,mNGS靈敏度相比常規培養及呼吸道病原體核酸檢測有提高,且差異有統計學意義。mNGS的陰性預測值遠高于前兩者檢測方法,且差異有統計學意義(P<0.001)。可見mNGS檢出假陰性的比例很低。mNGS的特異度雖然高于呼吸道病原體核酸檢測,但差異無統計學意義,且低于常規培養(P<0.05)。mNGS的這項屬性體現了其高假陽性率,盡管研究人員一直試圖提高mNGS在臨床診斷應用[14]中的特異性,但目前該缺點仍不容忽視。

mNGS檢測過程中的污染菌可能來自3個方面:標本采集時的污染菌、人類常規定植菌群、實驗室試劑和環境中的背景微生物。可采用定量或半定量的統計分析以便區分感染菌與定植菌。臨床工作中,通過mNGS檢測到的微生物需要結合疾病的臨床特點進一步評估確定,特別是對于未經常規檢測確診的病例。mNGS的另一個局限性是它無法區分檢測到的病原菌的致病性狀態。該研究mNGS在98份樣本中鑒定出130種致病細菌、真菌和19種病毒,其中部分屬于呼吸道共生菌或污染菌。檢測到的大量微生物信息對臨床醫師作出診斷時可能會產生困擾,甚至誤診。因此,在做出決策前,一定要結合患者的病情,綜合判斷。