Pirfenidone通過癌相關成纖維細胞抑制膽道腫瘤侵襲

魏亦成,王紫怡,李 煒,殷佩浩,

膽囊癌(gallbladder cancer,GBC)和膽管癌(cholangiocarcinoma,CCA)目前發病率在高收入國家呈上升趨勢,由于膽道腫瘤的侵襲性較強導致腫瘤惡性程度高和預后較差[1]。腫瘤的侵襲能力與腫瘤微環境(tumor microenvironment, TME)具有密切關系,其中癌相關成纖維細胞(cancer associated fibroblast,CAF)在腫瘤微環境中起到了重要作用。在CAF的過去研究中指出存在多種功能不同的CAF,例如炎性CAF和肌成纖維細胞CAF(myofibroblast-like CAF,myCAF)[2]。其中myCAF與膠原蛋白的產生相關[3]并且能夠增加細胞外基質的剛度[4],是TME形成和重塑的重要因素。

吡非尼酮(Pirfenidone,PFD)是一種新型抗纖維化劑,被批準用于特發性肺纖維化和其他纖維化相關疾病[5]。PFD可以通過抑制TGF-β的釋放從而抑制SMAD通路和膠原蛋白產生,具有抗纖維化和抗炎特性,表明PFD能夠抑制肌成纖維細胞功能[6]。如果PFD能夠改變腫瘤微環境中的myCAF功能,則對于抑制腫瘤侵襲具有重要意義。該研究就此提出假設PFD能否通過改變CAF的功能來影響相關腫瘤微環境從而抑制膽道腫瘤侵襲,并且探索PFD作用于CAF的相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 DMEM細胞培養基、雙抗、胰酶(含EDTA)(美國Gibco公司);胎牛血清(FBS)(德國BI公司);TGF-β ELISA試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);兔源FAP抗體 (英國Abcam公司, ab53066)、兔源p-smad3抗體 (美國CST公司, 9520S)、兔源smad2/3 (美國CST公司, 8685S)、兔源COL1A1(英國Abcam公司,ab138492)、兔源COL3A1(美國NOVUS公司, NB600-594),兔源COL4A1 (美國CST公司, 50273)、兔源p-smad2抗體 (美國CST公司, 18338)、鼠源VIM (美國CST公司, 5741S) 、鼠源α-SMA (英國Abcam公司, ab124964)、鼠源β-actin (英國Abcam公司, ab6276);PFD(平湖市正遠醫藥科技有限公司)。

1.1.2主要儀器 超低溫冰箱(青島海爾集團公司),全波長酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司),凝膠電泳儀、電泳槽、ChemiDoc MP成像儀(美國BIO-RAD公司),離心機(德國Hettich公司)。

1.1.3細胞 該課題選取膽囊CAF,膽管CAF,膽囊正常成纖維細胞(normal fibroblast,NF),膽管NF作為實驗對象,膽囊NF來自安徽來爾文科技有限公司,公司提供細胞相關驗證報告。GBC-SD人膽囊癌細胞,來自美國模式培養物集存庫ATCC細胞庫。組織來源的CAF,從膽囊癌和膽管癌患者的癌組織中分離得到。膽管NF,從正常膽管組織分離得到。細胞培養條件是37 ℃、5% CO2。所有參與這項研究的患者均表示同意。該研究及相關課題經上海普陀區中心醫院倫理委員會批準(倫理批準號: PTEC-A-2021-29-1)。

1.1.4實驗動物 雄性BALB/c裸鼠10只(6～8周齡30～40 g/只)和購自上海市計劃生育科學研究所動物實驗經營部,生產許可證號: SCXK(蘇) 2018-0006。動物實驗均在上海普陀區中心醫院 SPF 級動物實驗室進行,飼養條件為(22±2) ℃、濕度60%,明暗周期為 12 h /12 h,自由進食和飲水。將小鼠單側皮下接種GBC-SD人膽囊癌細胞形成皮下瘤小鼠模型。2周后腫瘤成型后進行隨機分組,以 BALB/c裸鼠5只為 PFD給藥組,以其余BALB/c裸鼠5只為正常對照。PFD給藥組每天灌胃1次,每次PFD 250 mg/kg,對照組給予生理鹽水,共2周。2周后收集兩組BALB/c裸鼠血清進行后續研究。該研究已獲得上海普陀區中心醫院倫理委員會批準(批件號:DWEC-A-202206013)。

1.2 方法

1.2.1原代CAF細胞提取 在培養皿中加入適量的生理鹽水后將所取患者組織標本塊置于其中,將多余脂肪、邊緣殘留組織清理掉,加入適當10%雙抗D-Hanks溶液清洗組織至澄清,用眼科剪將其剪碎至糊狀。將組織碎末轉移到離心管中,加入適量D-Hanks溶液完全淹沒組織,離心后棄去上清液。關燈避光,加入膠原酶,封口膜封住管口,置于37 ℃恒溫搖床中 150 r/min振蕩1 h。加入完全培養基吹打離散組織后離心5 min來清洗膠原酶,重復此步驟3次,待膠原酶全部去除后加入培養基轉移至小培養皿中放入培養箱中孵育。

1.2.2細胞分組 根據實驗目的將CAF分成4組:膽囊CAF組; 膽管CAF組,分別培養24 h;膽囊CAF+PFD組,膽囊CAF加入PFD后作用24 h;膽管CAF+PFD組,膽管CAF加入PFD后作用24 h,其中PFD濃度0.3 mg/ml,作用時間為24 h。

1.2.3條件培養基 當CAF增長到80%的濃度時,培養基被無血清的培養基取代。處理48 h后,收集細胞懸液作為條件培養基。高速離心后收集條件培養基,然后通過0.22 μm微孔膜過濾,在-20 ℃保存。

1.2.4Western blot檢測細胞蛋白表達 取對數成長期的細胞鋪板,48 h后去培養基,用PBS清洗3次后,用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的CST細胞裂解液進行蛋白裂解,置于冰上裂解15 min后,運用離心機離心提取蛋白。棄去沉淀后,取上清液,使用BCA蛋白檢測試劑盒進行蛋白定量。用10%的SDS-PAGE分離等量的細胞裂解物,并將分離后的蛋白轉移到PVDF膜上。用5% BSA封閉1 h后,按照蛋白分子量的大小分離不同條帶,將條帶與一抗孵育,一抗有FAP(1 ∶1 000)、α-SMA(1 ∶2 000)、VIM(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶5 000)、COL1A1(1 ∶1 000)、COL3A1(1 ∶1 000)、COL4A1(1 ∶1 000)、p-smad2(1 ∶1 000)、p-smad3(1 ∶1 000)、smad2/3(1 ∶1 000)。在4 ℃條件下孵育一抗12 h,用TBST漂洗3次后,與二抗在常溫下孵育1 h。再用TBST漂洗3次,使用化學發光顯色法進行顯色,用Image J軟件進行蛋白表達分析,每組試驗分別獨立重復3次,進行統計。

1.2.5ELISA檢測TGF-β水平 收集CAF的條件培養基和小鼠血清作為樣品。使用酶聯免疫吸附測定試劑盒測定TGF-β水平。將100 μl樣品加入抗體包被的96孔板的每個孔中,然后在室溫下孵育2 h。將100 μl的工作檢測溶液加到每個孔中,在加入100 μl底物溶液之前,將板在室溫下再孵育1 h。加入50 μl終止液后終止工作。在分光光度計中設置波長為450 nm,讀取相應吸光度。每個樣品設立3個復孔,分別獨立重復3次實驗,進行統計。

1.2.6膠原收縮實驗 將CAF懸浮液在無血清培養基和I型膠原溶液中混合,制備膠原凝膠。最終細胞密度為1.5×105個/ml,膠原濃度為1 mg/ml。將0.5 ml混合物加入到24孔板的每個孔中,在37 ℃下聚合30 min。將基質從培養皿底部輕輕分離,基質中的成纖維細胞在完全培養基中培養48 h,其中不含或含有PFD。每隔24 h白光下拍攝。通過Image J軟件對凝膠的表面積進行量化。收縮百分比使用公式100%×凝膠表面積/孔表面積,繪制為初始基質面積。每組收縮試驗分別獨立重復3次,進行統計。

1.2.7鬼筆環肽染色 將細胞固定后,用0.1%Triton X-100滲透,并用5% BSA在PBS中封閉30 min。然后用Alexa-Fluor 488 Phalloidin(A12379,Thermo Fisher Scientific)染色細胞,以觀察絲狀F-肌動蛋白。每種細胞分別鋪3個共聚焦皿,獨立進行染色觀察。

1.2.8明膠酶譜實驗 將來自CAF條件培養基在非還原性樣品緩沖液中以1 ∶1稀釋,并在含有0.1%明膠的10% SDS聚丙烯酰胺凝膠(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA USA)上在125 V下分離150 min。通過在室溫下與復性緩沖液(2.5%Triton X-100在水中稀釋)孵育30 min來去除SDS。凝膠在顯影緩沖液中洗滌30 min,然后在37 ℃的新鮮顯影緩沖液中培養48 h。凝膠用考馬斯藍染色。每組實驗獨立重復3次,觀察現象。

1.2.9Transwell實驗 在 Transwell小室的底膜使用基質膠鋪底后,置入 Transwell專用24孔板中。將處理后的細胞分別與300 μl無血清培養基混合后加入小室內;之后向小室下的孔中加入700 μl含10% FBS培養基。共培養48 h后,棄去培養基,使用甲醇將膜表面的細胞固定。使用結晶紫染色后,將小室晾干,在顯微鏡下拍照,在光學顯微鏡下計數細胞。每個樣品鋪3個小室,每組實驗獨立重復3次,進行統計。

1.2.10CCK-8實驗 細胞鋪板于96孔板中,并在24 h內加入PFD作用。24 h后,使用CCK-8檢測方法評估細胞活力,設置3個孔,分別獨立重復3次實驗,進行統計。

1.2.11mRNA表達水平檢測 qRT-PCR檢測TGF-β的mRNA表達水平。設計引物如下核苷酸序列F:TATTGAGCACCTTGGGCACTGTTG; R: CCTTAACCTCTCTGGGCTTGTTTCC方向(5′-3′);根據EZ-press RNA Purification Kit提取總RNA,用逆轉錄試劑盒提取cDNA,使用染料法qPCR檢測試劑盒進行qRT-PCR檢測。

2 結果

2.1 原代CAF提取及功能觀察分別從患者膽囊癌組織和膽管癌組織中提取原代CAF細胞,將其名稱定義為膽囊CAF和膽管CAF。分別提取2種CAF的蛋白后,通過Western blot檢測標志蛋白表達。如圖1A所示,Western blot實驗顯示細胞中的CAF標志蛋白FAP,Vimentin,α-SMA均表達,從而驗證CAF的身份。通過鬼筆環肽實驗分別對膽囊CAF和膽管CAF染色,圖1B顯示其成纖維細胞骨架膠原蛋白豐富且呈束狀分布,這提示2種CAF的功能可能與膠原蛋白相關從而影響腫瘤微環境。

2.2 CAF中的TGF-β分泌和膠原生成由于TGF-β/SMAD信號通路與成纖維細胞的膠原收縮和生成功能有重要聯系[6],所以通過ELISA和Western blot實驗進行進一步研究,實驗分組為膽囊NF組,膽管NF組,膽囊CAF組,膽管CAF組。ELISA實驗表明膽囊CAF和膽管CAF的TGF-β分泌分別強于正常成纖維細胞細胞(3 116.67±567.65),差異有統計學意義(F=82.09,P<0.05)。同時通過Western blot檢測膽囊CAF和膽管CAF中膠原蛋白顯示,COL1A1,COL3A1,COL4A1相較于正常NF明顯表達增高,兩者差異有統計學意義(FCOL1A1=54.39,FCOL3A1=112.00,FCOL4A1=186.90,P<0.05)。同時研究也表明膽囊CAF和膽管CAF中TGF-β/SMAD信號通路的標志蛋白p-smad2,p-smad3,smad2/3表達相較與正常NF增高,差異有統計學意義(Fp-smad2=90.04,Fp-smad3=162.20,P<0.05)。這提示膽囊CAF和膽管CAF相比NF具有更強的TGF-β分泌,并且激活TGF-β/SMAD通路來促進膠原生成。見圖2。

2.3 PFD抑制CAF對TGF-β分泌和膠原生成的影響為了研究PFD對于CAF中TGF-β分泌和膠原生成的影響,研究分組分為膽囊CAF組,膽管CAF組,膽囊CAF+PFD組,膽管CAF+PFD組。根據圖3A,CCK-8實驗患者膽囊CAF和膽管CAF在0.6、1.2、2.4、3.6、7.2、14.4 mg/ml PFD處理后與對照組0 mg/ml PFD處理后細胞存活率比較,差異有統計學意義(P<0.05)。故研究選擇對兩種細胞存活率無影響的PFD藥物濃度為0.3 mg/ml。結果如圖3B所示, qRT-PCR實驗表明PFD組相比對照組TGF-β的mRNA表達水平明顯降低, 差異有統計學意義(F=549.3,P<0.05)。圖3C顯示ELISA實驗表明PFD能明顯抑制CAF中TGF分泌(2 895.42±855.96), 差異有統計學意義(F=121.00,P<0.05)。同時圖3D顯示Western blot分析表明PFD能抑制膽囊CAF和膽管CAF的膠原蛋白表達,差異有統計學意義(FCOL1A1=29.94,FCOL3A1=405.90,FCOL4A1=479.10,P<0.05)。在圖3E、F動物實驗中相同條件下的GBC-SD患者膽囊癌細胞皮下瘤裸鼠模型中,PFD組相比對照組的血清TGF-β濃度明顯降低(364.52±220.60),差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3 PFD抑制CAF對TGF-β分泌和膠原生成的影響

2.4 PFD對CAF功能的作用為了研究PFD對CAF膠原收縮和重塑的影響進行了相關實驗,圖4A、B為膠原收縮實驗,結果顯示,膽囊CAF細胞加入PFD后與對照組24 、48 h收縮具有明顯差異,膽管CAF細胞加入PFD后與對照組24 h收縮差異不明顯,但是48 h收縮具有明顯差異,結果顯示PFD能夠明顯減弱膠原凝膠的收縮功能,兩者差異有統計學意義(P<0.05)。膠原收縮與癌相關成纖維細胞的基質重塑能力密切相關。圖4C的明膠酶譜實驗表明PFD對CAF分泌的MMP2和MMP9具有抑制作用。MMP2和MMP9是膠原重塑和腫瘤微環境形成的重要因素,這說明了PFD能通過CAF對腫瘤微環境的改變起到作用。

圖4 PFD對CAF功能的作用

2.5 PFD通過SMAD信號通路影響CAF功能及腫瘤微環境研究[6]表明,PFD能夠抑制TGF-β產生和相關的膠原蛋白產生。圖5顯示PFD可以抑制CAF中TGF-β下游的SMAD信號通路,p-smad2,p-smad3磷酸化蛋白明顯受到抑制,差異有統計學意義(Fp-smad2=193.4,Fp-smad3=575.2,P<0.05)。說明PFD可能是通過SMAD信號通路來抑制膠原蛋白的產生和重塑功能。為了研究CAF對腫瘤微環境的影響,進行了Transwell實驗,收集膽囊CAF組,膽管CAF組,膽囊CAF+PFD組,膽管CAF+PFD組的條件培養基,在相同條件下驗證患者膽囊癌GBC-SD細胞的侵襲能力的變化,結果顯示PFD能夠改變腫瘤微環境從而抑制腫瘤細胞侵襲(534.82±56.45),差異有統計學意義(F=123.6,P<0.05)。

圖5 PFD通過SMAD信號通路影響CAF功能及腫瘤微環境

3 討論

腫瘤微環境與腫瘤的發生發展和化療耐藥性密切相關,關系到腫瘤的侵襲功能并且影響腫瘤預后。多數膽囊癌和膽管癌患者術后復發率較高和化療效果較差,這與腫瘤微環境是密切相關的。伴隨對腫瘤微環境的研究增多,研究表明CAF是組成腫瘤微環境重要部分,由于CAF具有異質性,不同CAF的功能具有明顯區別。其中注意到膽道腫瘤中的CAF具有myCAF類似功能,可以通過膠原蛋白的生成和重塑對腫瘤微環境的改變起到重要作用。

在膽囊相關研究中表明膽囊癌的周圍組織的肌動蛋白染色百分比與正常相比更高,而肌動蛋白是myCAF重要標志。肌動蛋白影響細胞質中應力纖維和束狀組織,并且與膠原凝集相關[7]。在CAF的研究中表明TGF-β能夠激活CAF的相關功能從而促進腫瘤細胞的侵襲[8]。該研究通過提取原代CAF,進行了鬼筆環肽實驗并且驗證了TGF-β相關通路蛋白,從而證實了TGF-β信號通路在膽道CAF中的高表達,說明原代CAF具有myCAF的類似功能。在膽管癌腫瘤微環境中膠原的改變和重塑最腫瘤侵襲起到了重要作用[9]。該研究也通過膠原蛋白的Western blot實驗進行了驗證。

PFD是一類具有廣泛的抗纖維化和抗炎特性的藥物。PFD能過通過調節前膠原轉錄和限制成纖維細胞活化和分化為肌成纖維細胞來減緩纖維化[6]。Pirfenidone對不同類型的癌癥具有抗腫瘤潛力,在非小細胞肺癌中能提高化療的敏感性提高腫瘤治療效果[10]。腫瘤微環境研究[11]表明Pirfenidone具有通過靶向CAF促進乳腺癌細胞上皮間質轉化(EMT)和干細胞特征的作用。TGF-β在纖維化中起到了重要作用,通過Western blot實驗表明PFD能明顯抑制CAF的TGF-β分泌。TGF-β通路主要由TGF-β受體介導的Smad和非Smad信號通路組成。其中,活化的TGF-β與TGF-β受體2結合并激活TGF-β受體1,導致Smad2和Smad3的磷酸化,磷酸化后形成Smad復合物,然后轉運到細胞核以調節膠原蛋白和纖連蛋白,影響組織纖維化。

由于CAF在腫瘤基質中對惡性腫瘤的發生和發展起到了促進作用。如果能改變膠原生成和膠原重塑的進程,對腫瘤的發生和發展起到抑制作用。其中有對CAF選擇性缺失I型膠原的小鼠的研究表明,I型膠原在腫瘤微環境中的主導力是I型膠原-剛度途徑,在I型膠原所產生的機械限制與其剛度介導的作用發生變化時,Ⅰ型膠原可能對腫瘤的侵襲起到促進作用[12]。通過Western blot實驗表明PFD能夠抑制膠原蛋白的生成,進一步運用膠原收縮和明膠酶譜實驗證實PFD能夠明顯改變CAF的膠原收縮和重塑功能,這提示PFD通過膠原收縮和重塑改變了膠原的機械限制和剛度作用,隨后通過Transwell實驗表明PFD能夠改變CAF這一功能從而抑制腫瘤細胞的侵襲。為了尋求PFD的作用機制,驗證了TGF-β下游通路,最后通過Western blot實驗證實PFD主要是通過抑制TGF-β影響下游的SMAD信號通路起到作用。

綜上所述,該研究通過膽囊CAF和膽管CAF的原代細胞提取,提示在腫瘤微環境下TGF-β/SMAD信號通路影響CAF的膠原合成,其中PFD可以通過抑制TGF-β的產生來阻斷SMAD信號通路的激活和改變腫瘤微環境從而抑制腫瘤侵襲。