SPP1、PD-L1的表達與M2巨噬細胞在肝細胞癌中的關系及對預后的影響研究

吳婧婧,黃 琦,彭 瑤,楊 洋

肝癌作為全球范圍內最常見的癌癥之一,發病率在全球范圍內呈上升趨勢[1]。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝癌最常見的病理類型,約占90%。盡管傳統化療、肝動脈化療栓塞、免疫檢查點抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑等療法,一定程度上延長了患者的生存期,但總體預后仍較差。因此,迫切需要尋找有效的治療方法。

腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophages, TAM)是腫瘤微環境中浸潤的一類重要免疫細胞,以M2型為主,而CD163為目前公認的M2巨噬細胞標志物[2]。分泌性磷蛋白1 (secreted phosphoprotein 1, SPP1) 廣泛存在于人體的組織與器官內,其表達在多種腫瘤中均顯著上調[3-5],巨噬細胞陽性表達SPP1的結腸癌患者的無進展生存期 (progression free survival, PFS)更短[6]。但目前在HCC中針對SPP1的研究較少,且發揮作用機制尚不完全清楚。程序性死亡因子配體-1(programmed death receptor ligand-1, PD-L1)是程序性死亡因子-1(PD-1)的配體,B7超家族i型跨膜糖蛋白。PD-L1 在人體的多種免疫及腫瘤細胞表面表達[7-9],促進活化 T 細胞凋亡,抑制活化 T 細胞增殖。但HCC的免疫微環境中SPP1和PD-L1在調節巨噬細胞參與腫瘤免疫過程中發揮何種相互作用尚不明確。該研究將探索HCC中SPP1、PD-L1與M2巨噬細胞的表達及與患者預后的相關性,從而為靶向M2巨噬細胞治療HCC提供一定的實驗基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 病例資料該研究整群收集2017—2019年在安徽醫科大學第二附屬醫院初次診斷并接受手術的81例HCC患者和10例癌旁組織(對照組)的石蠟標本,取分界線以外相應一側2 cm的組織為癌旁組織。全組病例需符合的條件有:① 手術前未接受過放療或化療;② 年齡、性別、BCLC分期等資料完整;③ 標本組織經安徽醫科大學第二附屬醫院病理科專家再次確診為HCC。HCC病人肝組織石蠟切片中男70例,女11例,年齡30～78 (58.2±11.6)歲。其中,年齡≥60歲以上的患者38例(46.9%);BCLC分期A期57例(70.3%),B期14例(17.3%),C期10例(12.3%),無D期患者;肝臟單發腫瘤68例 (84.0%),多發腫瘤13例 (16.0%);腫瘤直徑>5 cm 46例(56.8%),腫瘤直徑≤5 cm 35例 (43.2%);有HBV感染患者71例(87.7%),無HBV感染患者10例(12.3%)。

1.2 試劑與儀器CD163(美國Santa Cruz公司);SPP1(江蘇親科生物研究中心有限公司);PD-L1(英國Abcam公司);石蠟切片機(上海徠卡儀器有限公司,RM2016); 脫水機(武漢俊杰電子有限公司,JJ-12J), 數字切片掃描儀Pannoramic MIDI(匈牙利3DHISTECH公司);光學顯微鏡(重慶重光實業有限公司,COIC,XSP-C204)。

1.3 方法

1.3.1免疫組化檢測肝組織石蠟切片SPP1、PD-L1和CD163的表達 HCC組織經甲醛固定、梯度乙醇脫水后,將組織和石蠟置于包埋框內,冷卻后即成蠟塊。進行防脫處理后,Leica石蠟切片機切成厚4～6 μm薄片,將蠟片裱貼于載玻片上,烤干待用。免疫組化法染色按MaxVision二步法進行,具體操作參照說明書。以磷酸鹽緩沖液(PSB)代替一抗作陰性對照,已知陽性切片為陽性對照。在光學顯微鏡(COIC公司,XSP-C204)下結合常規HE切片觀察免疫組化切片的染色反應。數字切片掃描儀下進行拍照。

觀察 SPP1、PD-L1和CD163在細胞中的染色情況,在細胞膜或者細胞質中出現棕黃色著色為陽性細胞,根據細胞的染色強度以及陽性細胞率進行評分。① 按染色強度記分: 無色0分, 淡黃色1分, 棕黃色2分, 棕褐色3分; ② 按陽性細胞率計分:陽性細胞率≤4%(0分),5%～24%(1分),25%～49%(2分),50%～74%(3分),陽性細胞率≥75%(4分),兩者結果相乘即為總評分,總評分≤1分為陰性,2～4分為弱陽性,5～8分為中等陽性,9～12分為強陽性。在該研究中將陰性和弱陽性定義為低表達,中等陽性和強陽性定義為高表達。

1.3.2隨訪 隨訪方式為電話隨訪,截止時間為2022年4月30日。該研究中有 79例患者取得完整隨訪資料。總生存時間為手術時間到死亡或隨訪截止時間。到隨訪截止時間未死亡的患者定義為結尾數據。

1.4 統計學處理應用SPSS 26.0軟件進行統計分析。采用四格表的χ2檢驗、Fisher確切概率法分析兩種蛋白在肝癌組織及癌旁組織中的表達與患者臨床特征關系。兩種蛋白與生存期分析采用Kaplan-Meier 法對總生存期 (overall survival, OS) 繪制生存曲線,并進行log-rank檢驗影響,生存時間的危險因素采用單因素和多因素Cox回歸模型。采用χ2檢驗分析兩種蛋白之間及與M2巨噬細胞表達的相關性。當P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SPP1、PD-L1和CD163在肝癌中的表達81例HCC患者組織中,高表達SPP1、PD-L1和CD163的患者例數分別為39 (48.1%),32 (39.5%)和38 (48.1%),高于癌旁組織 (P<0.05 )。見圖1。

圖1 SPP1、 PD-L1和CD163在HCC、癌旁組織中的表達 ×100

2.2 SPP1、PD-L1和CD163的表達與HCC患者臨床特征的關系SPP1、PD-L1和CD163的高表達與HCC患者BCLC分期均相關(P<0.05),與年齡、性別均無關(P>0.05)。同時,SPP1的表達還在腫瘤直徑大、肝內多發腫瘤的HCC中患者中增高;PD-L1的表達在肝內多發腫瘤、有HBV感染的HCC患者中增高(P<0.05)。見表1。

表1 HCC組織中SPP1、PD-L1和CD163的表達與其臨床病理特征的關系(n)

2.3 SPP1和PD-L1在HCC組織中表達的相關性及與HCC患者生存的相關性(包括單因素、多因素生存分析)

2.3.1SPP1和PD-L1在HCC組織中表達的相關性 39例SPP1高表達的HCC患者中有21例PD-L1高表達,SPP1和PD-L1在HCC組織中呈正相關 (c=0.272,P=0.011)

2.3.2生存因素分析 對81例HCC病例進行單因素COX回歸模型分析,結果顯示BCLC分期、SPP1高表達和PD-L1高表達均與HCC患者預后相關(P<0.05),將上述因素納入多因素COX回歸模型分析,結果顯示BCLC分期、SPP1高表達和PD-L1高表達均是影響預后的獨立因素(P<0.05)。見表2、3。

表2 81例HCC患者預后的單因素COX回歸模型

表3 81例HCC患者預后的多因素COX回歸模型

2.3.3SPP1、PD-L1和CD163的表達與HCC患者生存情況的關系 81例患者中79例患者隨訪,其中73例患者在隨訪期內死亡(94.9%),死因均與腫瘤相關。全組患者3年生存率為24%,SPP1, PD-L1和CD163的高表達均與預后相關(P<0.01,P<0.01,P=0.01)。見圖2。

圖2 SPP1、PD-L1和CD163的表達與HCC患者生存時間的關系

2.4 SPP1和PD-L1與肝癌組織M2巨噬細胞的相關性39例HCC組織SPP1高表達患者中有30例CD163高表達,SPP1和CD163在HCC組織中呈顯著正相關 (r=0.485,P<0.001);32例HCC組織PD-L1高表達患者中有20例CD163高表達,PD-L1和CD163在HCC組織中呈顯著正相關 (r=0.226,P=0.038)。

3 討論

HCC是消化系統常見腫瘤,其病因至今尚不完全明確,缺乏有效治療手段,總體預后不佳,因此迫切需要新的治療方法。腫瘤微環境主要指腫瘤細胞與非腫瘤細胞(免疫細胞、成纖維細胞、血管和淋巴管內皮細胞)及細胞外成分(細胞因子及趨化因子,細胞外基質等)相互作用形成的復雜結構。巨噬細胞、T淋巴細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)、中性粒細胞、樹突狀細胞和骨髓源性抑制細胞(MDSCs)等主要免疫細胞組成了腫瘤免疫微環境[10]。巨噬細胞是單核細胞系的分化細胞,不同微環境中,表現為不同亞型,主要分為M1和M2型。一般認為TAM更接近于M2表型,可被IL-10、IL-13、IL-4激活,具有促進腫瘤生長和轉移作用[11-12]。

課題組前期研究[13]表明,晚期HCC患者的M2巨噬細胞表達增多,該研究表明M2巨噬細胞在HCC患者腫瘤組織中的高表達明顯高于癌旁組織,同時在腫瘤直徑大、BCLC分期晚的患者中表達升高。其機制可能為晚期HCC患者中β2-AR表達升高,下游cAMP/PKA/CREB和cAMP/IL-6/STAT3信號通路被激活,使M2巨噬細胞分泌促腫瘤細胞因子如IL-6等增多,促進了肝癌進展。但是否有其他機制作用于M2巨噬細胞,影響肝癌進展仍需深入研究,本文進一步研究了SPP1、PD-L1與M2巨噬細胞及與預后的相關性。

SPP1是一種重要的細胞外基質成分,由多種細胞分泌,包括腫瘤細胞、免疫細胞、成纖維細胞、破骨細胞、平滑肌、淋巴細胞和上皮細胞。在多種腫瘤的腫瘤組織和血清中SPP1的表達上調與患者不良預后相關[14-16]。有研究[17]表明,在肺腺癌中,SPP1可調節巨噬細胞向M2型極化,但具體機制尚不清楚,在HCC中研究較少。該研究表明,SPP1在HCC患者腫瘤組織中的表達高于癌旁組織,在BCLC分期晚、腫瘤直徑大、肝內多發腫瘤病灶的患者中升高,且為肝癌患者的獨立預后因素,高表達SPP1的患者生存期短于低表達患者。同時,SPP1的表達與M2巨噬細胞的數量呈正相關,提示針對SPP1靶點的治療可能是改善HCC患者預后的潛在治療方案。

PD-L1在腫瘤免疫逃逸中起關鍵作用,靶向PD-L1已成為多種癌癥的一線治療方法[18]。研究[19]表明,抑制SPP1下游Cdk5基因的表達可減弱腫瘤細胞PD-L1的表達,并促進抗腫瘤免疫。本研究中,PD-L1的表達與HCC患者的年齡和性別無明顯相關,在肝內多發腫瘤、有HBV感染的HCC患者中增高,且為HCC患者預后獨立因素,PD-L1高表達HCC患者生存期較低表達患者縮短。PD-L1的表達與SPP1的表達、M2巨噬細胞的數量呈正相關。上述研究結果為今后在HCC治療中,聯合使用SPP1抑制劑和PD-L1抑制劑提供了一定的理論依據。

綜上所述,該研究表明了HCC患者中SPP1、PD-L1和CD163的異常高表達,并且與患者的預后不良密切相關,臨床監測SPP1、PD-L1和CD163的表達有助于預測HCC患者的預后。同時SPP1、PD-L1和CD163的表達有一定的相關性,提示SPP1和PD-L1可能通過對巨噬細胞的調節作用影響HCC發生發展。通過抑制SPP1和PD-L1的表達干預HCC腫瘤微環境中巨噬細胞的極化過程,可能為今后HCC的靶向治療及免疫治療提供有利的理論依據。