舌鱗狀細胞癌中DKK1的表達及分子機制

孫 玥,王宏浩,李聽雨,楊敏根,黃漢瀟,后 軍

頭頸部腫瘤占常見惡性腫瘤的第6位,其中大多數為口腔鱗狀細胞癌[1]。舌鱗狀細胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)起源于舌復層鱗狀上皮細胞,約占口腔鱗狀細胞癌的1/3 ～ 1/2,具有惡性程度高、早期易轉移和預后差等特點。目前臨床治療主要以手術切除為主,以放療和化療為輔[2],然而由于舌周圍的淋巴管和血管豐富,TSCC生長速度快、早期易發生淋巴結和遠處轉移,且缺乏有效的分子標志物,患者的5年生存率僅33% ～ 40%[3]。因此,探尋新的分子標志物對TSCC患者的早期診斷和治療具有重要意義。Dickkopf相關蛋白1(DKK1)是一種Wnt/β-cateinin信號通路的抑制分子[4],其在多種腫瘤中表達異常,并在腫瘤的進展和轉移進程中發揮重要作用。關于DKK1在腫瘤如結腸癌[5]、肺癌[6]等方面的功能研究已有報道,但DKK1在口腔鱗狀細胞癌中的作用還不清楚。因此,該研究通過分析DKK1在TSCC組織和細胞中的表達水平以及可能的分子機制,為DKK1靶向治療TSCC提供依據。

1 材料與方法

1.1 數據來源從TCGA數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov)中下載TSCC患者轉錄組核糖核酸測序(RNA-seq)數據和臨床預后信息[7]。收集到162例TSCC患者數據,包含147例TSCC組織(15例原發腫瘤,132例病理類型不明)和15例癌旁組織。UALCAN數據庫分析520例頭頸部鱗狀細胞癌組織和44例正常組織中DKK1的mRNA表達狀況。

1.3 差異表達基因的生存分析應用Kaplan-Meier分析方法篩選上述差異表達基因中與TSCC患者生存率相關的基因,篩選的條件是P<0.05。采用Lasson回歸法篩選TSCC患者中表達量與生存率呈負相關的代表性基因。應用Ualcan TCGA analysis網址(https://ualcan.path.uab.edu/)分析與TSCC患者生存相關的差異表達基因在TSCC組織與正常口腔組織中的表達狀況。

1.4 GO功能和KEGG通路富集分析GO功能富集分析包括細胞組分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MP)、生物過程 (biological process,BP),而KEGG數據庫用于分析差異表達基因的信號通路。通過可視化數據分析網站(the database for annotationvisualization and integrated discovery, DAVID)對1.2中篩選出的基因進行GO功能和KEGG通路富集分析(https://david. ncifcrf.gov/)[9]。

1.5 病例資料收集2020年12月—2022年2月經手術切除的TSCC組織50例標本,樣本均經病理檢查確診。其中,男性30例,女性20例;年齡<60歲者23例,年齡≥60歲者27例;腫瘤直徑<3.0 cm者39例,腫瘤直徑≥3.0 cm者11例;分化程度:高分化20例,中分化26例,低分化4例;無淋巴結轉移者35例,有淋巴結轉移者15例。

1.6 免疫組化實驗

1.6.1采用免疫組化SP法檢測DKK1抗體在TSCC中的表達狀況 免疫組化SP(北京中杉金橋公司,SP-9000),DKK1抗體(英國Abcam公司,1 ∶800稀釋,ab109416),石蠟組織切4 μm厚度,65 ℃烤片2 h,二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,微波爐EDTA抗原修復液處理2 min。之后步驟按照試劑盒說明書操作,滴加一抗,4 ℃過夜,滴加二抗,DAB顯色,中性樹膠封片。選用一抗陽性染色切片作為陽性對照,以 PBS 代替一抗的染色結果作為陰性對照。

1.6.2免疫組化結果判讀 DKK1陽性染色評分標準以著色強度及著色細胞數綜合判斷。隨機選擇5個未出現重復視野的組織進行觀察,同時計數視野內的細胞。以半定量積分法作為判斷結果,同時采用雙盲閱片法進行評分。按陽性細胞著色強度計分:無陽性著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;按細胞陽性細胞數計分:陽性細胞數<25%為0分,25% ～ 50%為1分,51% ～ 75%為2分,陽性細胞數>75%為3分。將上述2項得分相乘作為最終評分:0分為陰性組,評分≥1分為陽性組。

1.7 細胞培養HOEC和Cal27細胞均購自American Tissue Culture Collection公司。細胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養基,置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養,待細胞密度約70%～80%時,收集細胞。

1.8 Western blot實驗收集上述細胞沉淀,加入高效RIPA裂解液提細胞蛋白,采用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,轉移蛋白至PVDF膜上。加入DKK1(1 ∶1 000)、β-catenin(1 ∶1 000)、p-p65(1 ∶1 000)、p65(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶5 000)低溫過夜孵育,再加入HRP標記的的二抗(1 ∶10 000)常溫孵育1.5 h,最后用凝膠成像儀曝光。

1.9 細胞轉染實驗選取生長狀態良好、細胞密度處于50%左右時進行實驗。采用Mate轉染試劑,具體操作步驟參考試劑盒說明書,轉染48～72 h后提取細胞蛋白進行下游蛋白檢測。DKK1-siRNA序列:5′-GAGGAAACCAUCACUGAAATT-3′,3′ -UUUCAGUGAUGGUUUCCUCTT-5′。

1.10 統計學處理采用SPSS 22.0軟件進行統計分析,DKK1蛋白表達與TSCC臨床病理特征的相關性分析用采用χ2檢驗法,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

圖1 TSCC患者中的差異表達基因

2.2 生存分析實驗應用Kaplan-Meier分析方法篩選上述7 150個差異表達基因與TSCC患者生存率的關系(以P<0.05為篩選條件),共獲得1 802個基因與患者生存率相關。進一步分析顯示,在上述基因中,有761個基因在TSCC組織中高表達,并與患者的生存率密切相關。通過采用Lasso回歸法在這716個基因中篩選關鍵基因,實驗獲得3個在TSCC組織中表達量與生存率呈負相關的基因(表達量越高,患者生存率越低),如圖2所示。

圖2 關鍵基因的生存曲線

2.3 差異表達基因的GO功能和KEGG通路富集分析為更深入了解上述761個差異表達基因(在TSCC組織中高表達,并與患者生存率相關)的功能,實驗利用 David網站對其進行GO功能和 KEGG 通路富集分析。如圖3A所示,BP結果顯示差異基因主要富集于細胞外基質、細胞器裂變、細胞核分裂和核染色體分離等生物過程;CC結果顯示,差異基因在質膜外側面、黏著斑、細胞底物連接膠原蛋白和細胞外基質內質網腔等部分成分較為豐富。同時,KEGG 通路富集分析表明,差異表達基因在細胞因子與受體間相互作用、中性粒細胞聚集、膠質瘤、細胞周期和細胞黏附分子等功能中較為活躍(圖3B)。

圖3 差異表達基因的GO功能和KEGG功能富集分析

2.4 DKK1在TSCC及正常口腔組織中的mRNA表達通過UALCAN數據庫分析520例HNSC組織和44例正常組織中DKK1的mRNA表達狀況。結果顯示,與正常組織相比,HNSC組織中DKK1的mRNA表達水平增加(P<0.001,圖4A)。進一步分析DKK1的mRNA表達與HNSC臨床病理特征的相關性,結果顯示其與HNSC臨床分期、組織學分級和淋巴結轉移密切相關(P<0.001,圖4B-D)。與正常組織組相比,DKK1的mRNA在不同臨床分期(P<0.001,圖4B)、組織學分級(P<0.001,圖4C)和淋巴結轉移狀態(P<0.001,圖4D)HNSC組織中的表達水平均增強。

圖4 UALCAN數據庫分析DKK1 mRNA在HNSC中的表達水平

2.5 DKK1在TSCC及癌旁組織中的蛋白表達免疫組化結果顯示,DKK1蛋白主要定位于胞質,其在癌旁組織中呈陰性或低表達,在TSCC組織中呈高表達(圖5)。在50例TSCC組織中,DKK1蛋白的陽性率(84%,42/50)高于癌旁正?？谇唤M織(18%,9/50)(P<0.001)。見表1。

表1 正常舌組織和TSCC組織中DKK1蛋白的表達[n(%),n=50]

圖5 TSCC組織中DKK1 蛋白的表達 ×100

2.6 DKK1與TSCC臨床病理特征的關系通過分析DKK1表達與TSCC臨床病理特征的相關性研究表明,DKK1表達與TSCC臨床分期相關(P<0.05),而與TSCC患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織學分級、淋巴結轉移無相關性(P>0.05)(表2),與UALCAN數據庫分析結果相一致。其中DKK1蛋白在臨床分期Ⅲ+Ⅳ期TSCC組織中的陽性率(92.5%,37/40)高于Ⅰ+Ⅱ期TSCC組織(50%,5/10)(P<0.05)(表2)。上述結果提示DKK1蛋白可能參與TSCC的惡性演進。

表2 DKK1蛋白表達與舌癌臨床病理特征的關系[n(%)]

2.7 敲低DKK1對β-catenin、p-p65和p65表達的影響Western blot實驗顯示,與正常人口腔上皮細胞HOEC相比,DKK1在TSCC細胞Cal27中的蛋白表達水平升高。為探索DKK1在TSCC腫瘤中潛在的作用機制,實驗利用siRNA敲低TSCC細胞中的DKK1的表達。Western blot實驗結果顯示,與對照組相比,DKK1敲低組Cal27細胞中β-catenin、p-p65和p65蛋白表達水平下降。見圖6。

圖6 DKK1在TSCC細胞中的表達及其下游靶點

3 討論

DKK1基因全稱是“dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 1”,其編碼的DKK1蛋白是具有2個富含半胱氨酸結構域的分泌蛋白,屬于Dickkopf家族[10]。DKK1蛋白通過與LRP6共受體結合,抑制Wnt/β-catenin信號通路并參與胚胎發育、骨骼形成和多種癌癥的發生發展過程[11]。由于腫瘤微環境的不同和癌癥復雜的調控機制,DKK1蛋白對不同腫瘤中的不同發展階段具有不同的影響[12]。目前,DKK1作為一個腫瘤相關性抗原,能激發特異性的CD4+輔助T細胞、CD8+CTL的細胞免疫應答以及靶向DKK1的體液免疫應答。此外,DKN-01是一種抑制DKK1蛋白的人源化單克隆抗體,與免疫治療藥物替雷利珠單抗和化療聯合使用,治療多發性骨髓瘤、胃癌和胃食管交界癌患者[13]。DKK1蛋白與甲胎蛋白的聯合應用,可將肝細胞癌的總體診斷率提高到87.5%[14]。DKK1在多種腫瘤組織中高表達,可通過下調NK細胞功能和促進骨髓瘤源性抑制細胞MDSCs在癌組織中的聚集來抑制抗腫瘤免疫反應,促進腫瘤的生長與轉移[15]。

該研究采用生物信息學方法,通過TCGA數據庫篩選到162例TSCC患者,通過癌組織和癌旁組織的NetworkAnalysed分析,共獲得7 150個差異基因。通過Kaplan-Meier分析和Lasson回歸法,實驗篩選到3個表達量與生存率呈負相關的關鍵基因DKK1、CYP19A1和IRX4。其中,UALCAN數據庫和免疫組化實驗顯示DKK1的mRNA和蛋白水平在TSCC組織中呈高表達,并且該蛋白與TSCC患者的臨床分期相關,這提示DKK1可能促進TSCC腫瘤的發生和惡性演變等生物過程。此外,Western blot實驗顯示DKK1蛋白在TSCC細胞Cal27中的表達高于正?？谇簧掀ぜ毎鸋OEC。 在TSCC細胞Cal27中敲低DKK1的表達后,β-catenin、p-p65和p65的表達水平也發生相應下降,這提示DKK1可能通過下調β-catenin、p-p65和p65表達來調控TSCC腫瘤的惡性生物學進展過程。