維生素D通過影響PBMC炎癥相關(guān)基因?qū)BD的機制研究

徐艷秋,陳衛(wèi)剛

炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases, IBD)是一種與克羅恩病(Crohn′s disease, CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)相關(guān),發(fā)生在人體胃腸道的一種慢性炎癥性潰瘍性疾病[1]。IBD的主要臨床表現(xiàn)是腹瀉、夜間排便、腹痛、體質(zhì)量減輕和疲勞等。UC通常只影響結(jié)腸,而CD則影響從口腔到肛門的整個胃腸道。IBD的發(fā)病率在歐美國家大約在0.3%[2],其發(fā)病機制尚不清楚,但關(guān)鍵因素包括遺傳、環(huán)境、免疫、腸道微生物等。

隨著研究的進展,人們逐漸認識到維生素D在調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫方面發(fā)揮了重要的作用;研究表明維生素D可能影響腸道上皮完整性、天然免疫屏障功能以及T細胞的發(fā)育和功能。在遺傳易感人群中,維生素D缺乏可能是導致IBD發(fā)病的一個因素,其含量的變化可能會影響疾病活躍度[3]。在IBD患者經(jīng)過抗炎治療后,與未治療患者具有較低比例的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),且PBMC中炎癥因子顯著下降[4]。但目前對于維生素D是如何通過影響炎癥反應(yīng)及免疫系統(tǒng)對IBD的作用機制尚未表明,因此,該課題通過研究維生素D對PBMC的影響,探討其在IBD中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 病例資料及分組收集石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2018年10月—2021年10月消化內(nèi)科門診確診但未進行系統(tǒng)治療的成年IBD活動期患者共190例,以活動期癥狀及腸鏡結(jié)果為準,其中UC患者128例,CD患者62例。對UC患者和CD患者平均隨機各分為2組,一組為常規(guī)治療組(美沙拉嗪1 g,每6 h服用1次),一組為常規(guī)治療+維生素D組(美沙拉嗪1 g,每6 h服用1次+維生素D 400 U 每日1次),共計4組。該研究通過倫理委員會批準,入組患者均簽署相關(guān)知情同意書,臨床資料從門診和住院病歷資料中獲取。

1.2 差異性表達基因的篩選通過檢索GEO數(shù)據(jù)庫中下載關(guān)于維生素D對單個核細胞中mRNA的表達矩陣,確定數(shù)據(jù)庫為GSE50012,其中mRNA平臺為GPL10558,包括24個病例,12個對照組病例(GSM8321138-GSM832184)和12個服用維生素D病例(GSM1212354-GSM1212376)。使用R語言(3.6.3版本)中Limma包[5]用于分析差異性表達的mRNA,確定不同表達的mRNA和差異表達的基因(differentially expressed genes, DEGs)。使用“ggplot2”包繪制火山圖。

1.3 基因本體論(gene ontology, GO)和KEGG富集分析通過使用在線數(shù)據(jù)庫DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)將上述DEGs進行篩選,篩選條件為|log2FC|>1, adjP<0.05,作為候選基因進行GO和KEGG分析,GO分析按照分子功能、細胞定位、生物途徑對候選基因進行注釋。使用“ggplot2”包繪制氣泡圖。

1.4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction, PPI)的構(gòu)建以及Hub基因的篩選對上述篩選后的DEGs進行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,使用在線軟件STRING(https://string-db.org/)進行分析,通過該網(wǎng)站進一步尋找DEGs之間潛在的聯(lián)系。對于輸出后數(shù)據(jù)使用Cytoscape軟件中cytoHubba插件尋找互作網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵基因,用于后續(xù)實驗分析。

1.5 血液樣本中單個核細胞的獲取對所有納入人群分為4組,住院后獲取患者血液樣本,出院后對患者進行隨訪規(guī)律用藥2個月后前往門診再次抽血獲取血液樣本,使用EDTA抗凝管保存。收集后的血液樣本進行梯度離心法獲取到單個核細胞,對獲取到的細胞使用細胞裂解液Takara RNAiso plus裂解細胞,后將沉淀靜置5 min后于-80 ℃冰箱中保存。

1.6 總RNA的提取按照總RNA 提取試劑盒的方法提取血液中單個核細胞中總RNA,利用Taqman mRNA Reverse Transcription Kit試劑盒和普通反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,按照Taqman mRNA kit試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行qRT-PCR反應(yīng),得到數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt法進行處理,計算表達量。引物序列見表1。

表1 7個關(guān)鍵基因引物序列

1.7 研究流程對收治患者填寫量表,采用改良Truelove和Witts疾病嚴重程度分型及蒙特利爾分類表對患者進行病情判斷,對于活動期,進行規(guī)范化治療3個月后再次評估患者的活動期及緩解期。活動期腸鏡判斷標準:可見病變黏膜彌漫性充血、水腫,質(zhì)脆,膿性分泌物附著,并發(fā)糜爛、淺小潰瘍。靜止期:黏膜炎癥減輕,蒼白,出血少,正常結(jié)構(gòu)消失,黏膜干燥粗糙。

2 結(jié)果

2.1 mRNA的差異性表達情況通過R語言分析可以得到兩組不同表達的基因,在GSE50012中共計獲得差異性表達基因128個,其中與對照組比較,高表達基因數(shù)為53個,低表達基因數(shù)為75個(Log2FC>1,P<0.05),見圖1A、B;進一步分析數(shù)據(jù)獲得火山圖和PCA圖,其中低表達為藍色,高表達為紅色,見圖1C、D。

圖1 服用與未服用維生素D外周血單個核細胞中差異性基因表達

2.2 DEGs富集分析為了進一步分析差異性表達基因所參與的通路及可能發(fā)揮的功能,采用DAVID數(shù)據(jù)庫對篩選出的所有基因進行富集分析,通過KEGG分析主要參與細胞因子-細胞因子受體相互作用、IBD、用于 IgA 的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)信號通路等,見圖2A。通過GO分析所得,篩選與該研究高度相關(guān)的通路及功能,細胞成分(cellular component, CC)分析顯示含膠原細胞外基質(zhì)、質(zhì)膜外側(cè)、富含ficolin-1顆粒、液泡膜、囊泡腔、溶酶體膜等,見圖2B;分子功能(molecular function, MF)結(jié)果顯示DEGs參與趨化因子受體結(jié)合、細胞因子活性、趨化因子活性、細胞因子結(jié)合、CXCR 趨化因子受體結(jié)合等,見圖2C;在生物學過程(biological process, BP)中,主要參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫效應(yīng)過程、對細菌來源分子的反應(yīng)、中性粒細胞活化、中性粒細胞介導的免疫、參與免疫反應(yīng)的中性粒細胞活化、淋巴細胞介導的免疫、T細胞活化、淋巴細胞活化的調(diào)節(jié)、細胞因子產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)等,見圖2D。

2.3 差異性表達mRNA的GSEA分析情況對所有差異性表達的基因進行篩選,取Log2FC>1.5,P<0.05后,再次對所篩選后分子進行GSEA分析,結(jié)果表明差異性表達的分子主要參與了Vitamin D受體途徑[P<0.01,校正后的富集分數(shù)(NES)=2.479]、反應(yīng)肽配體結(jié)合受體(P<0.01,NES=-2.132),KEGG趨化因子信號通路(P<0.01,NES=-2.020)。見圖3。

圖3 差異性表達基因的GSEA分析結(jié)果

2.4 差異性表達基因PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建對所有差異性表達的基因進行篩選,設(shè)置條件為Log2FC>1.5,P<0.05,篩選后分子通過在線網(wǎng)站String得到35個節(jié)點蛋白分子的互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系(P<0.001),下載相關(guān)數(shù)據(jù)后導入Cytoscape軟件,根據(jù)Dgree和Log2FC值得到差異性基因的互作網(wǎng)絡(luò)圖,見圖4A。再次通過Cytoscape軟件中CytoHubba插件篩選出關(guān)鍵位置的7個基因,分別為IL-6、MMP9、CXCL9、CXCL10、TREM1、IL1R2、C1QB這7個關(guān)鍵基因,見圖4B。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

2.5 納入患者的一般資料在該院門診就診的患者進行一般資料的比較,其中UC患者共128例,CD患者62例,兩種疾病患者在性別上無顯著差異(P=0.718),在年齡分布上UC患者要高于CD患者(P=0.016),兩組在發(fā)病中位時間上無顯著差異(P=0.632)。見表2。

表2 納入患者的一般資料

2.6 維生素D對IBD的病情影響將處于活動期的UC患者及CD患者隨機分為常規(guī)治療組、常規(guī)治療+維生素D組,按療程規(guī)范治療3個月后再次對所有納入患者進行評分,結(jié)果顯示在UC患者中加服用維生素D緩解率為93.75%,進行常規(guī)治療患者緩解率為81.25%,且兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);CD患者加服用維生素D后緩解率為90.32%,行規(guī)范化治療患者緩解率為67.74%,且兩組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 UC和CD患者臨床緩解情況

2.7 候選mRNA在患者中的表達情況為了進一步分析差異性表達基因在常規(guī)治療組、常規(guī)治療+維生素D組中的表達,結(jié)合Hub基因和參與維生素D通路的基因成功篩選出7個,分別為HLA-DMA、HLA-DMB、IL-6、NOD2、MMP9、CXCL9、CXCL10。通過qRT-PCR的方法測定在UC和CD患者中常規(guī)治療組、常規(guī)治療+維生素D組的表達情況,結(jié)果表明:與常規(guī)治療組比較,常規(guī)治療+維生素D組中HLA-DMA、HLA-DMB、IL-6、MMP9、CXCL9、CXCL10呈低表達,而NOD2呈高表達,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與常規(guī)治療組比較,常規(guī)治療+維生素D組中HLA-DMA、HLA-DMB、IL-6、MMP9、CXCL9、CXCL10呈低表達,而NOD2呈高表達,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),與UC患者的表達結(jié)果一致。見圖5。

圖5 臨床患者中關(guān)鍵基因的差異性表達

3 討論

IBD主要是由炎癥和免疫系統(tǒng)紊亂介導的疾病,而維生素D在維持胃腸道屏障完整、監(jiān)測腸道微生物群和炎癥免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用。前期研究[6]顯示,維生素D缺乏在IBD患者中很常見,其患病率高于一般人群,且CD略高于UC。造成這種情況的原因主要包括免疫抑制、飲食限制和營養(yǎng)吸收障礙等。但既往研究無法確定兩者之間的因果關(guān)系,該研究通過了解兩者的作用機制,尋找新證據(jù),探究維生素D缺乏、補充與疾病嚴重程度的關(guān)系,對于IBD的治療提供更有利的方案。

由淋巴細胞組成的外周血單個核細胞在介導免疫調(diào)節(jié)和長期的慢性炎癥過程中發(fā)揮了重要的作用[7]。該研究通過是否服用維生素D為變量,結(jié)果顯示單個核細胞中差異性表達的基因共計128個,其中高表達基因數(shù)為53個,低表達基因數(shù)為75個,表明維生素D可以與單個核細胞表面的維生素D受體結(jié)合,影響下游基因的表達。Burczynski et al[8]研究顯示,在IBD患者的單個核細胞尋找差異性表達的基因,在UC和CD之間基因表達存在差異;在此基礎(chǔ)上Tom et al[9]又通過檢測IBD患者中外周血單個核細胞中的Treg細胞和Th17細胞的比例,較正常人均升高,側(cè)面印證了外周血單個核細胞確實在IBD中介導了免疫調(diào)節(jié)。Mohammadi et al[10]高通量測序檢測了CD患者外周血單個核細胞中miRNA的變化,同樣驗證了下游靶分子參與了BD的免疫反應(yīng)。

通過GO和KEGG富集分析顯示差異性表達的大部分基因參與炎癥反應(yīng)、免疫效應(yīng)、介導免疫等過程,從而參與了IBD的發(fā)生和發(fā)展。維生素D可能通過與外周血單個核細胞上VDR結(jié)合引起下游分子的變化,引起外周血中基因改變,參與IBD患者的炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)。KEGG顯示主要存在IBD和IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò),可能是維生素D可以調(diào)節(jié)腸道中IgA的表達進而影響IBD的預(yù)后。Palm et al[11]同樣表明在IBD中IgA呈強陽性。Lucafò et al[12]同樣表明在IBD患者血清中IL10和IgA水平升高,IgA水平的變化與腸道菌群失調(diào)有著密切關(guān)系,IgA通過調(diào)節(jié)腸道黏膜發(fā)揮抑制炎癥的作用。GSEA結(jié)果表明差異性表達的分子主要參與VDR途徑、KEGG趨化因子信號通路等,大量的研究集中于趨化因子與IBD之間的關(guān)系,通過參與IBD細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導、炎癥細胞的激活和趨化,增加單核細胞黏附分子的表達和游走能力。本文猜測維生素D可能也會影響外周血單個核細胞中趨化因子的變化影響疾病的進展,通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析篩選出IL-6、MMP9、CXCL9、CXCL10、TREM1、IL1R2、C1QB這7個關(guān)鍵基因。

為進一步驗證差異性表達基因在IBD中的作用,在UC中加用維生素D后緩解率明顯升高,說明維生素D可加速UC進入緩解期。Battistini et al[13]的研究表明30 ng/ml的維生素D可以有效降低IBD的活動性,處于緩解期的IBD患者血清中存在高水平的維生素D。該研究在對CD患者的研究中得到同樣的結(jié)果。進一步檢測4組患者7個基因的表達量,與未加用維生素D患者相比較,加用維生素D后HLA-DMA、HLA-DMB、IL-6、MMP9、CXCL9、CXCL10呈現(xiàn)低表達,而NOD2呈現(xiàn)高表達。HLA-DMA和HLA-DMB均屬于HLA II類旁系同源物,主要在抗原呈遞細胞(APC、B淋巴細胞、樹突細胞、巨噬細胞)中表達,參與炎癥因子的趨化。IL-6是一種多效性細胞因子,能趨化白細胞定向移動的小分子分泌蛋白[12],而IBD發(fā)病是由于促炎因子連續(xù)釋放。MMP9在IBD中的研究較少,但該研究表明MMP9作為趨化因子之一,在IBD患者的血清中呈現(xiàn)高表達,但具體機制并未闡明,需要進一步驗證。CXCL家族同樣是趨化因子中重要的組成部分,其中CXCL9、CXCL10是CXCR3的配體,具有促進炎癥的作用,既往Carey et al[14]研究表明與健康對照組相比較,IBD患者結(jié)腸黏膜中上皮細胞CXCL10明顯升高,其升高與IL-17的分泌增加有關(guān)。研究表明維生素D可以抑制病變部位的炎癥反應(yīng),進而抑制趨化因子CXCL9、CXCL10的表達。