AMD3100下調CA9與CXCR4表達逆轉索拉菲尼耐藥

秦驥偉,鄭 浩,徐治軍,栗雪峰,孫 成

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球致死率第4的惡性腫瘤,也是全球第6大常見癌癥[1]。手術切除是早期HCC的標準治療方法,但超過80%的HCC患者被診斷時已無法進行根治性手術。索拉菲尼作為晚期HCC的一線藥物作用于多個靶點,可顯著延長晚期HCC患者的生存時間[2-3]。然而,索拉菲尼的獲得性耐藥限制了其臨床療效。

碳酸酐酶IX(carbonic anhydrase IX,CA9)是一種膜相關鋅金屬酶,可使腫瘤細胞在低氧酸性微環境中存活[4-6],并在多種惡性腫瘤中表達上升。低氧微環境使腫瘤細胞生存能力和侵襲性增強,更易遠處轉移及產生耐藥性[5,7]。趨化因子受體4(CXC chemokine receptor Type 4,CXCR4)是一種參與血管生成和腫瘤侵襲的趨化因子受體,研究表明其在HCC、乳腺癌等多種腫瘤類型中表達,并在其轉移擴散中發揮重要作用[8-12]。AMD3100是CXCR4的特異性拮抗劑,既往研究[10,13]表明AMD3100可抑制多種腫瘤的轉移和增殖,增加腫瘤對化療和放療的敏感性。因此,該研究通過分析CA9和CXCR4在HCC中的表達,以AMD3100作為研究對象,研究其對索拉菲尼耐藥HCC細胞的增殖、侵襲和耐藥性影響,對探討HCC惡性傾向以及HCC的索拉菲尼耐藥機制具有重要的科研和臨床價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人源HCC Huh7、HepG2 細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2藥物與試劑 AMD3100購自美國Selleck Chemicals公司;索拉菲尼購自美國Selleck Chemicals公司;CCK-8購自日本Dojindo公司;β- actin購自德國Sigma公司;胎牛血清、青-鏈霉素雙抗、2.5%胰酶購自美國Gibco公司;PBS購自生工生物工程(上海)股份有限公司;SDS-PAGE上樣緩沖液購自上海碧云天生物技術有限公司;CXCR4購自美國Santa Cruz公司;CA9購自美國Gene Tex公司;transwell小室購自美國Corning公司;Mitrogel購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 將Huh7和HepG2細胞培養在含有10%胎牛血清以及1%青-鏈霉素雙抗的培養液中,置于37 ℃ 5% CO2培養箱中培養。

1.2.2HCC索拉菲尼耐藥細胞的建立 采用濃度梯度遞增法構建 Huh7/Sor和HepG2/Sor耐藥細胞株,以濃度為5 μmol/L的索拉菲尼作為起始濃度進行誘導,逐步進行濃度爬坡,每次爬坡濃度約提高1.5倍,每14 d爬坡1次,最終得到穩定耐受濃度為15 μmol/L的索拉菲尼的 Huh7/Sor和HepG2/Sor耐藥細胞株。Huh7/Sor和HepG2/Sor細胞株培養在含有10 μmol/L 索拉菲尼的培養液以維持其耐藥性。實驗前5～6 d,將Huh7/Sor和HepG2/Sor細胞恢復至正常培養液中培養。

1.2.3CCK-8法檢測AMD3100和索拉菲尼對HCC細胞及HCC索拉菲尼耐藥細胞增殖毒性作用的影響 課題組預實驗表明不同濃度AMD3100處理后降低Huh7/Sor細胞對索拉菲尼的耐藥性,50 μmol/L組和100 μmol/L 組效果最明顯且兩組間差異無統計學意義,本研究后續實驗均采用50 μmol/L AMD3100,見表1。取對數生長期Huh7、HepG2、Huh7/Sor、HepG2/Sor細胞以及以50 μmol/L的AMD3100預處理90 min的Huh7/Sor和HepG2/Sor細胞接種于96孔板內,每孔加100 μl培養基,細胞密度為5×104個/ml。待細胞融合到80%,以梯度稀釋的方法分別加入由完全培養基配制的2.5、5.0、10.0、20.0、30.0 μmol/L的索拉菲尼。Control組加等量培養液,各組均設3個復孔,另設調零孔(培養液)。將96孔板置入37 ℃、5% CO2細胞培養箱48 h,棄去各孔內液體,每孔加入100 μl含10% CCK-8的培養液,置于培養箱內孵育4 h。用酶標儀測定各孔在450 nm波長下的吸光值(A),細胞存活率=(A實驗組-A平均Control組)/(A平均對照組-A平均Control組)×100%,計算出索拉菲尼對4種細胞生存率的影響及相應的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。

表1 不同濃度AMD3100對HCC索拉菲尼耐藥細胞的增殖毒性作用的影響

1.2.4Transwell小室法檢測AMD3100對HCC細胞及HCC索拉菲尼耐藥細胞的侵襲能力的影響 Matrigel 基質膠冰面上液體化后,與 DMEM 培養基按1 ∶3稀釋后在膜下室側涂抹。將鋪基質膠的小室置于37 ℃孵育箱 30 min 使基質膠凝固。胰酶消化下處理過的Huh7、Huh7/Sor細胞制成單細胞懸液,細胞密度用無血清DMEM 培基調至約2.5×104個/ml,下室加 600 μl無血清DMEM 培基, 吸取 200 μl細胞懸液均勻加入上室。分為Huh7、Huh7/Sor和上室含有50 μmol/L的AMD3100的Huh7、Huh7/Sor共4組。12 h后,取出小室PBS洗滌,4%多聚甲醛溶液固定30 min。將小室置于0.1%結晶紫甲醇溶液中染色10 min,光學顯微鏡下計數每孔5個高倍視野下穿過基底膜的細胞數目并拍照。

1.2.5Western blot法檢測AMD3100對HCC細胞及HCC索拉菲尼耐藥細胞CA9及 CXCR4蛋白表達水平的影響 將Huh7、HepG2、Huh7/Sor、HepG2/Sor細胞分為0 μmol/L組和5 μmol/L 索拉菲尼處理組,以5×104個/ml密度接種至6孔板,每孔2 ml。細胞融合至70%時,分別換成無血清培養基和含5 μmol/L 索拉菲尼的無血清培養基,實驗組加入AMD3100 (終質量濃度為50 μmol/L)處理90 min。用 RIPA 緩沖液分別溶解各組細胞,BCA法檢測蛋白質濃度。每孔加樣25 g相應總蛋白質進行蛋白SDS-PAGE電泳,轉移至PVDF 膜上。50 g/L脫脂牛奶封閉1 h,加入一抗CXCR4(1 ∶1 000)、CA9(1 ∶1 000)置于4 ℃冰箱過夜。TPBS清洗膜后加入二抗,37 ℃ 搖床放置2 h。用 DNR 生物成像系統進行發光、測試、照相,使用Image J軟件圖像分析,計算出各組細胞中CA9和CXCR4蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 AMD3100和索拉菲尼對HCC細胞及HCC索拉菲尼耐藥細胞的增殖毒性作用的影響結果顯示,Huh7/Sor組在2.5、5.0、10.0、20.0和30.0 μmol/L的索拉菲尼濃度下的增殖效率高于Huh7/Sor+AMD3100組和Huh7組,差異有統計學意義(P<0.05)。HepG2/Sor組在2.5、5.0、10.0、20.0和30.0 μmol/L的索拉菲尼濃度下的增殖效率高于HepG2/Sor+AMD3100組和HepG2組,差異有統計學意義(P<0.05 )。應用Probit回歸分析估算出索拉菲尼對 Huh7、HepG2、Huh7/Sor、HepG2/Sor的IC50值。 索拉菲尼對 Huh7、HepG2、Huh7/Sor、HepG2/Sor的IC50值分別為6.40、6.95、11.51、11.70 μmol/L,根據耐藥指數(resistance index,RI)=IC50(耐藥細胞)/IC50(親本細胞)計算得出Huh7/Sor和HepG2/Sor細胞對索拉菲尼的RI分別為1.80和1.68。AMD3100可以增加 Huh7/Sor和HepG2/Sor細胞對索拉菲尼的敏感性,提高索拉菲尼對Huh7/Sor和HepG2/Sor細胞的抑制作用,降低IC50值。AMD3100處理后,Huh7/Sor和HepG2/Sor細胞對索拉菲尼的IC50值分別從11.51和11.70 μmol/L降至9.01和10.36 μmol/L,RI也分別從1.80和1.68降至1.41和1.49。見表2。

表2 AMD3100和索拉菲尼對HCC細胞及HCC索拉菲尼耐藥細胞的增殖毒性作用的影響

2.2 Transwell小室法檢測HCC細胞及HCC索拉菲尼耐藥細胞的侵襲能力結果顯示,12 h后Huh7/Sor+AMD3100組遷移細胞數(196.45±29.94)較Huh7/Sor組(292.15±60.80)減少,差異有統計學意義(t=-5.003,P<0.05)。Huh7+AMD3100組遷移細胞數[(183.24±65.81)個]較Huh7組[(238.83±50.36)個]減少,差異有統計學意義(t=-2.458,P<0.05)。Huh7組遷移細胞數[(238.83±50.36)個]少于Huh7/Sor組[(292.15±60.80)個],差異有統計學意義(t=-2.376,P<0.05)。這表明Huh7/Sor細胞擁有比Huh7細胞更強的侵襲能力,而AMD3100處理后可以降低Huh7細胞和Huh7/Sor細胞的侵襲能力。見圖1。

圖1 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力

2.3 Western blot法檢測AMD3100對HCC細胞及HCC索拉菲尼耐藥細胞CA9及 CXCR4蛋白表達水平的影響① 在各細胞組中,AMD3100處理組細胞的CA9蛋白表達水平均低于Control組(P<0.05);0 μmol/L 索拉菲尼處理條件下,Huh7組細胞和HepG2組細胞的CA9蛋白表達水平均低于Huh7/Sor組細胞和HepG2/Sor組細胞(t=-8.086,P<0.01;t=-8.086,P<0.01);5 μmol/L 索拉菲尼處理條件下,Huh7組細胞和HepG2組細胞的CA9蛋白表達水平均低于Huh7/Sor組細胞和HepG2/Sor組細胞(t=-2.570,P<0.05;t=-3.679,P<0.05)。見圖2。② 在各細胞組中,AMD3100處理組細胞的CXCR4蛋白表達水平均低于Control組(P<0.05);0 μmol/L 索拉菲尼處理條件下,Huh7組細胞的CXCR4蛋白表達水平低于Huh7/Sor組細胞(t=-8.855,P<0.01);5 μmol/L 索拉菲尼處理條件下,Huh7組細胞和HepG2組細胞的CXCR4蛋白表達水平均低于Huh7/Sor組細胞和HepG2/Sor組細胞(t=-2.570,P<0.05;t=-3.724,P<0.05)。見圖3。結果提示:與Huh7和HepG2細胞比較,Huh7/Sor和HepG2/Sor細胞的CA9和CXCR4蛋白表達增加;AMD3100處理Huh7、HepG2、Huh7/Sor和HepG2/Sor細胞后,可降低其CA9及CXCR4的蛋白表達水平。

圖2 Western blot法檢測AMD3100對HCC細胞中CA9相對蛋白表達水平的影響

圖3 Western blot法檢測AMD3100對HCC細胞中CXCR4相對蛋白表達水平的影響

3 討論

HCC是目前世界范圍內發病率和病死率均居前列的人類惡性腫瘤之一,尤其是在以中國為代表的東亞地區[1]。由于早期HCC無明顯臨床癥狀,超過80%的HCC患者被診斷時已經處于晚期狀態,無法進行根治性手術或肝移植。同時晚期HCC患者還面臨化療有效率低,放療及肝動脈介入栓塞化療不能解決肝外轉移等問題。

索拉菲尼是晚期HCC的標準臨床治療藥物之一。然而,由于索拉菲尼通常在6個月內發生原發性或獲得性耐藥,故僅有約30%的HCC患者因索拉菲尼的治療而受益[14]。目前,索拉菲尼耐藥的具體機制尚不明確。近年有研究[7,14]表明,索拉菲尼耐藥性的產生可能與HCC的腫瘤低氧微環境的發生發展有關。目前已在多個實體惡性腫瘤的研究中發現腫瘤低氧微環境的形成,低氧是由不良的血管形成和旺盛的代謝活動引起的,并與化療藥物耐藥性的產生、惡性腫瘤的侵襲性增加和預后不良有關[7,14-15]。因此,抑制低氧被認為是克服耐藥性的可行方法。一般情況下,低氧可以通過轉錄因子低氧誘導因子1(hypoxiainducible factor-1,HIF-1)的α亞基的過度表達來檢測。然而,HIF-1α的穩定性非常有限,CA9作為一個更穩定的分子參數通常作為低氧的替代標志物。CA9是HIF-1的特異性轉錄靶基因,但比HIF-1α更穩定,并且可通過與CO2的水合作用穩定細胞外pH值,從而影響實體腫瘤的進展。在低氧條件下,CA9啟動子區的低氧反應元件與HIF-1α結合,從而導致CA9表達上調[4]。因此,CA9在本研究中被用作低氧標志來進行檢測。

CXCR4是基質細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)α的趨化因子受體。最近的研究[10-12]表明,CXCR4參與血管生成和細胞遷移,在低氧微環境和HIF-1a調節下表達上調。索拉菲尼可以通過增加腫瘤組織中的低氧、炎癥和纖維化來觸發HCC中的促癌微環境。SDF1α/CXCR4軸在索拉菲尼治療后表達上調,并在增強癌細胞存活、募集腫瘤相關骨髓衍生細胞、增加結締組織增生和促進HCC轉移表型中發揮關鍵作用。鑒于CXCR4信號傳導的致癌作用,因此,對于晚期HCC患者, 阻斷CXCR4軸可能與目前的標準治療——索拉菲尼和免疫檢查點抑制劑(如抗PD-1)具有協同作用,同時具有對抗索拉菲尼的耐藥作用[11]。AMD3100是第1個被FDA批準的可用于外周血干細胞移植的CXCR4拮抗劑[10],與CXCR4特異性結合并抑制CXCR4與趨化因子CXC配體12之間的相互作用,且與其他趨化因子受體無交叉反應。

基于目前索拉菲尼耐藥現狀,本研究建立了索拉菲尼耐藥HCC細胞系Huh7/Sor和HepG2/Sor,結果顯示Huh7/Sor和HepG2/Sor細胞有著更強的侵襲能力,并且索拉菲尼耐藥HCC細胞系Huh7/Sor和HepG2/Sor細胞中CA9和CXCR4的蛋白表達水平相對于Huh7和HepG2細胞提高。在本研究中,經AMD3100處理后,Huh7、HepG2、Huh7/Sor和HepG2/Sor細胞的侵襲能力受到了抑制,同時降低了細胞中CA9和CXCR4的蛋白表達水平。以上研究表明CA9和CXCR4可能在HCC中的索拉菲尼的耐藥性產生過程中扮演了重要的作用,并促進了HCC的侵襲。對CXCR4的拮抗可有效降低HCC的索拉菲尼耐藥性,并降低HCC的侵襲能力。