電針法對兔膝關節炎模型治療效果及機制研究

鄭一鳴,李倫蘭,陳和木

膝關節骨關節炎(knee osteoarthitis,KOA)是一種慢性勞損導致的關節退行性疾病,累及軟骨、軟骨下骨等結構[1],超過35%的中老年人受其影響[2]。由于軟骨無神經與血管組織,被破壞結構和受損的關節軟骨修復緩慢。KOA常采用藥物和手術治療[3]。目前,非類固醇抗炎藥是治療KOA的常用藥物,但長期用藥會產生嚴重副作用[4]。因此,對于病情較輕或存在手術禁忌證的患者,確定有效安全的干預措施非常重要。電針是一種基于針灸的中西醫結合治療方法,其原理是通過針灸和電的雙重刺激來達到治療疾病的目的[5]。雖然電針已被廣泛應用于治療KOA,但作用機制尚未明確。

該實驗研究電針法對兔KOA模型血清、關節液中炎癥因子的影響和關節軟骨組織形態學改變,觀察電針法治療KOA效果及其作用機制,評價電針法在治療KOA過程中的應用價值,拓展中醫在防治KOA中的積極意義,為KOA的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組18只骨骼完整、6月齡成年雄性新西蘭兔(2.25～2.75 kg),由安徽醫科大學實驗動物中心提供并進行飼養[許可證號:SYXK(皖)2017-006]。動物實驗方案經安徽醫科大學動物倫理委員會批準(倫理編號:LLSC20221122)。經過1周適應性飼養后,18只新西蘭兔運用隨機數字表法被分配到空白對照組(A組)、模型對照組(B組)和電針法組(C組),每組各6只。

1.2 主要材料電子針灸治療儀(型號:CMNS6-1型)購自蘇州佳健器械總廠;全波長酶標儀購自無錫華衛德朗公司;高速組織研磨儀購自武漢賽維爾公司;生物組織自動包埋機、石蠟包埋機(冷臺)購自湖北貝諾醫療科技有限公司;顯微鏡購自日本NIKON公司;蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購自美國Solarbio公司;兔白細胞介素(interleukin,IL)-1β,IL-6,ELISA試劑盒購自武漢科鹿生物公司,批號:ELK1228、ELK2419;NO試劑盒購自上海碧云天生物公司;一抗:p-P38購自美國Cell Signaling Technology公司,貨號4511T;二抗:超敏兔鼠通用二抗購自北京ZSGB-BIO公司,貨號:PV-9000。

1.3 方法

1.3.1造模及干預措施 A組未經處理,正常飼養;B組和C組采用改良韋德曼左后肢伸直位固定制動法[6]制備模型。助手控制兔使其呈仰臥位,操作者把兔左后肢拉至充分伸展(膝關節伸展180°,踝關節60°背屈)。從腹股溝到跖趾關節內層纏繞綿紙,外層用樹脂繃帶包裹1周以鞏固固定,待樹脂繃帶變硬后,最外層以膠帶包裹防止兔啃咬。每天早晚巡視,若兔出現足趾充血、腫脹,應立即去除繃帶,待腫脹消退后重新造模。若出現樹脂繃帶滑脫,應立即修復。6周后拆除外部石膏固定裝置,驅使兔行走奔跑,B、C組兔膝關節紅腫,步態呈跛行、拖行狀,膝關節活動范圍受限,表明造模成功。所有兔正常飼養1周后繼續實驗,A、B組自由活動、常規飼養,每周與C組同一時間抓取5次,不做干預,連續4周;C組參照《實驗針灸學》[7]敘述,選擇內外膝眼、梁丘穴、血海穴,以0.3 mm×25.0 mm毫針進行針刺,直刺或斜刺均可。刺入深度約5 mm,將針與電針治療儀進行連接,強度以局部皮膚肌肉的輕微震顫為度,頻率為2、100 Hz疏密交替,電流強度 1～2 mA,治療每次20 min,每周治療5 d,休息2 d,連續4周。

1.3.2行為學觀察 干預完成后,采用改良Lequesne MG膝關節級別評估量表作為評分標準,觀察各組兔的疼痛、步態、關節活動和腫脹程度。選取2位對該實驗分組不知情的實驗助理擔任評分員,在同一時間對同一只兔進行評分,結果取均值。

1.3.3標本采集 取材方法如下:耳緣靜脈取血3～5 ml,靜置2 h后取上清液,以3 000 r/min快速離心10 min,-80 ℃貯存待測血清中炎癥因子表達水平。空氣栓塞法處死兔,暴露左膝淺層滑囊,在髕上囊開口,注射器抽取1 ml無菌鹽水灌注于髕上囊中,操作人員充分活動其膝關節,重復回抽直到收集3 ml關節液,快速離心取上清液,置于-80 ℃液氮中。切開關節囊,使膝關節腔充分暴露,切開十字韌帶,清除半月板,分離關節。使用咬骨鉗取左側股骨內側髁,沖洗后固定于4%多聚甲醛中48 h,經修剪、乙醇梯度脫水、常規石蠟包埋、切片后進行HE染色,鏡下觀察拍照記錄。根據Mankin分級標準對軟骨退化程度進行分級。

1.3.4ELISA法檢測血清、關節液中IL-6、IL-1β含量 按照試劑說明書進行操作,將試樣置于酶標板孔的底端,輕輕搖晃攪拌均勻,將蓋板或薄膜覆于酶標板上方,37 ℃下孵育80 min后清洗。添加 TMB顯色劑溶液,37 ℃下避光培養20 min。最后加入終止液進行檢測。

1.3.5Griess法檢測血清及關節液NO水平 按照試劑說明書操作,取出Griess reagentⅠ和Ⅱ,靜置恢復室溫。用待測樣品所用溶液稀釋標準品,按50 μl/孔,96孔板中加入標準品及樣品。按50 μl/孔,各孔中加入室溫Griess reagent Ⅰ,按50 μl/孔,在各孔中加入室溫Griess reagent Ⅱ,540 nm測定吸光度值。

1.3.6HE染色觀察膝關節軟骨組織病理形態 切片后行HE染色,將染色后切片放置于鏡下放大100倍觀察。使用Mankin評分法對膝關節軟骨退化程度進行評分,得分越高,說明軟骨退化程度越明顯。

1.3.7免疫熒光染色法觀察兔膝關節軟骨組織p-P38 MAPK表達 取制備的石蠟切片經脫蠟、孵育、水洗、浸泡,抗原修復后孵p-P38一抗過夜,孵二抗50 min,復染細胞核后甘油明膠封片,顯微鏡鏡檢。每組切片隨機選取3個100倍視野拍照,使用Image J軟件進行圖像采集分析。藍色熒光為DAPI表達,紅色熒光為p-P38陽性表達,Merge為雙重熒光染色。

2 結果

2.1 行為學觀察與空白對照組比較,模型對照組兔Lequesne評分升高 (P<0.05);與模型對照組比較,電針法組兔Lequesne評分降低 (P<0.05)。見圖1。

圖1 兔KOA模型行為學觀察

2.2 各組兔血清、膝關節液中IL-1β、IL-6、NO表達水平與空白對照組比較,模型對照組兔血清、膝關節液中IL-1β、IL-6、NO水平升高 (P<0.05);與模型對照組比較,電針法組兔血清、膝關節液中IL-1β、IL-6、NO水平降低 (P<0.05)。見圖2、3。

圖2 各組兔血清中IL-1β、IL-6、NO表達水平

圖3 各組兔關節液中IL-1β、IL-6、NO表達水平

2.3 各組兔膝關節軟骨組織鏡下病理形態觀察HE染色結果顯示,空白對照組軟骨細胞核完好,呈梭狀有序排列,可見清晰潮線;模型對照組切面損傷較大,細胞簇狀無序排列,潮線不清;電針法組軟骨細胞外形基本正常,胞核和胞膜完好,可辨潮線。見圖4。

圖4 各組兔膝關節軟骨組織鏡下病理形態 HE×100

2.4 軟骨組織Mankin評分與空白對照組比較,模型對照組Mankin評分升高(P<0.05);與模型對照組相比,電針法組Mankin評分降低(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組兔膝關節軟骨組織Mankin評分比較

2.5 各組兔膝關節軟骨組織免疫熒光p-P38表達與空白對照組比較,模型組膝關節軟骨組織p-P38免疫熒光染色陽性細胞數量增加(P<0.05);與模型對照組相比,電針法組膝關節軟骨組織p-P38免疫熒光染色陽性細胞數量減少(P<0.05)。見圖6、7。

圖6 各組兔膝關節軟骨組織免疫熒光染色 ×100

圖7 各組免疫熒光染色p-P38陽性細胞比例比較

3 討論

KOA是影響人類健康的常見關節疾病之一,通常認為是生物學和機械損傷共同作用下,軟骨細胞、軟骨外基質等合成降解失衡產生的結果。研究[8]表明,炎性因子及軟骨代謝相關細胞因子是導致KOA發病的重要因素。

針灸療法,包括手針、電針等,被認為是預防和延緩KOA進展的有效干預措施。研究[9]表明,手針對于KOA患者具有一定治療效果。電針在手針的基礎上,將針灸與電脈沖相結合,其機制可能是內分泌系統釋放激素,自主神經系統釋放神經遞質,調節細胞因子分泌和機體免疫反應,緩解患者的臨床癥狀。研究[10]表明,電針法對KOA有良性作用,但具體機制尚不明確。

該研究采用Lequesne評分評價電針法干預治療后的各組兔膝關節功能。評分結果顯示,與模型對照組相比,電針法組兔Lequesne評分顯著降低(P<0.05),表明電針法能改善KOA膝關節功能,對KOA有一定治療作用。

細胞因子由多種細胞分泌、調控、介導免疫及炎癥反應。研究[11]表明,IL-1β、IL-6、NO在KOA患者滑液中表達增加。IL-1β可促進金屬蛋白酶MMP家族和Ⅱ類膠原蛋白合成,誘導性NO合成酶激活,產生大量下游產物[12],強烈刺激iNOS mRNA轉錄,合成大量NO[13]。高濃度NO一方面抑制軟骨細胞,降低其再生能力;另一方面增強血管通透性,導致關節液滲出。IL-6只在KOA患者滑膜中可被檢出,加劇關節炎癥反應[14],調節MMPs,促進破骨細胞激活,加速基質和成纖維細胞的降解,進一步損害膝關節軟骨。MAPK信號轉導通路是由多種細胞因子活化的絲氨酸-蘇氨酸激酶,受IL-1β等炎性因子刺激時,MAPK通路以逐步磷酸化的方式被激活,加快誘導關節軟骨細胞外基質的降解,誘發KOA。研究[15]表明,MAPK信號轉導通路是KOA重要信號轉導通路,參與軟骨細胞增殖、凋亡和炎癥反應等多種生理過程。該研究通過動物實驗顯示,KOA兔經過4周電針法治療后,血清、關節液中IL-1β、IL-6、NO表達水平較模型對照組降低(P<0.05),膝關節軟骨組織中p-P38表達較模型對照組下降(P<0.05)。鏡下病理形態觀察電針法組呈大致正常狀態,與Mankin評分結果一致,表明電針法治療KOA機制是一種多靶點、多機制的綜合調控系統:軟骨表面損傷導致血管裂紋增多,同時,炎癥因子刺激軟骨,引起軟骨鈣化。干擾軟骨和軟骨之間相互作用,形成KOA的“惡性循環”。電針法通過下調血清和關節液中炎性因子表達水平,阻遏細胞內炎性物質釋放,阻止了“惡性循環”的發生。