百草枯中毒大鼠的GO及KEGG分析

徐煜城 張志強

[摘要]?目的?探討百草枯中毒后機體蛋白質表達變化及受影響的信號通路。方法?采用同位素標記相對和絕對定量技術檢測百草枯中毒大鼠肺組織中差異表達蛋白，對差異表達蛋白進行基因本體論（gene?ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）分析。結果?百草枯中毒大鼠肺組織中發現84種差異蛋白，其中48種上調，36種下調。在百草枯中毒早期，差異蛋白主要存在于細胞外區域，主要涉及代謝和應激，補體和凝血級聯通路、2-氧代羧酸代謝途徑、神經活性配體-受體相互作用途徑和金黃色葡萄球菌感染途徑4條信號通路受到明顯影響。結論?差異蛋白和信號轉導通路在百草枯致肺損傷早期即可產生變化，可能與炎癥損傷和肺纖維化有關。

[關鍵詞]?百草枯中毒；同位素標記相對和絕對定量技術；蛋白質組分析；急性肺損傷

[中圖分類號]?R595.4??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.16.018

GO?and?KEGG?analysis?for?paraquat?posioned?rats

XU?Yucheng，?ZHANG?Zhiqiang

Department?of?Emergency，?Binzhou?Medical?University?Hospital，?Binzhou?256600，?Shandong，?China

[Abstract]?Objective?To?explore?the?changes?of?protein?expression?and?the?affected?signal?pathway?after?paraquat?poisoning.?Methods?The?isobaric?tags?for?relative?and?absolute?quantitation?technique?were?used?to?detect?the?differentially?expressed?proteins?in?the?lung?tissues?of?paraquat?poisoning?rats，?and?the?gene?ontology?（GO）?functional?enrichment?analysis?and?Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes?（KEGG）?analysis?were?carried?out?for?these?differential?expressed?proteins.?Results?Eighty-four?different?proteins?were?found?in?lung?tissue?of?paraquat?poisoning?rats，?among?which?48?were?up-regulated?and?36?down-regulated.?In?the?early?stage?of?paraquat?poisoning，?differential?proteins?mainly?existed?in?extracellular?regions?and?were?mainly?involved?in?metabolism?and?stress.?Four?signaling?pathways，?including?complement?and?coagulation?pathway，?2-oxycarboxylic?acid?metabolic?pathway，?neuroactive?ligand-receptor?interaction?pathway?and?Staphylococcus?aureus?infection?pathway，?were?significantly?affected.?Conclusion?Differential?proteins?and?signal?transduction?pathways?can?be?changed?in?the?early?stage?of?paraquat?induced?lung?injury，?which?may?be?related?to?inflammatory?injury?and?pulmonary?fibrosis.

[Key?words]?Paraquat?poisoning;?Isobaric?tags?for?relative?and?absolute?quantitation?technique;?Proteomic?analysis;?Acute?lung?injury

在過去的幾十年里，超過120個國家使用百草枯除草，尤其是亞洲。誤食百草枯對患者的危害極大[1]。百草枯對成年人的致死劑量為20～40mg/kg，百草枯誤食后，大部分被小腸吸收，經血液轉運至多個器官并導致功能障礙[2]。因百草枯的特殊結構，肺泡上皮細胞和Clara細胞中特有的多胺轉運體會主動攝入，并使其在肺中蓄積[3]。實驗表明，通過主動轉運最終肺中百草枯濃度可達血漿的10倍[4-5]。在中毒初期，肺組織受損，隨即出現肺水腫及炎癥細胞浸潤[6]；在5d至數周的時間內出現肺Ⅱ型上皮細胞代償增生及肺纖維化[7-8]。因無特效解毒藥，治療主要通過催吐、利尿、洗胃和血液灌流以減少其吸收或增強其代謝[9-10]。為研究百草枯中毒動物肺組織中蛋白質含量的變化，筆者通過同位素標記相對和絕對定量（isobaric?tags?for?relative?and?absolute?quantitation，iTRAQ）技術篩選百草枯染毒大鼠肺組織中的差異蛋白。通過生物信息學分析差異蛋白，找出與其相關的信號通路，為后續進一步研究百草枯中毒所致的急性肺損傷提供檢測指標與實驗方向。

1??材料與方法

1.1??中毒模型建立

本研究經濱州醫學院附屬醫院動物倫理委員會審核批準（倫理審批號：20220128-98）。于濱州醫學院動物實驗中心飼養大鼠18只，自由飲食，正式實驗前于SPF條件下飼養7d。將大鼠隨機分為實驗組（T1、T2、T3）和對照組（C1、C2、C3），每組各3只。參照前期基礎研究，實驗組大鼠行腹腔注射百草枯30mg/kg，對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水[11-12]。給藥后大鼠在常規環境中繼續飼養1周，到采集標本前無大鼠死亡，實驗組大鼠出現呼吸急促、口唇發紺、食欲下降，與之前實驗結果相符合，考慮建模成功[13]。

1.2??肺組織蛋白提取

處死大鼠，收集每只大鼠的右肺中葉。每一組的3個肺組織剪碎后混為1管。使用試劑盒提取每一組肺組織的蛋白質，并對其所含蛋白質進行定量測定。

1.3??iTRAQ標記與肽段鑒定

從每一組中取200μg蛋白質預處理后于37℃下酶解12h獲得肽段。各組取100μg肽段，按照試劑盒說明書進行iTRAQ標記。將標記后的樣本復溶，漩渦震蕩，離心后取上清液，使用高效液相色譜法分離，取60個1.5ml?EP管，從第5分鐘開始依次收集洗脫液。將收集到的洗脫液真空冷凍干燥離心，為使肽段分布均勻，使用5μl?0.5%的甲酸重溶EP管中的樣品并交叉混合，再次離心，取上清液10μl，每份樣品采用納升級超高效液相色譜儀進行分離后使用質譜儀進行分析。最后使用Proteome?Discover軟件查找每種蛋白質的信息。根據FC<0.667或FC>1.5和P<0.05找到差異蛋白。獲得所有蛋白質信息后，對蛋白質進行基因本體論（gene?ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）分析。

2??結果

2.1??差異蛋白鑒定結果

獲得9009個肽段，通過與數據庫進行比較，鑒定出84種差異表達蛋白，其中48種高表達，36種低表達，見圖1、圖2。此外，上調的蛋白質差異較大，最多可達4倍，其中前4個上調最明顯的蛋白質分別是A0A0G2K9B1（LOC299282）、Q5PQU1（Kng2）、G3V729（Prg2）及A0A0G2JVQ5（Kng1）。

2.2??GO功能富集分析

對差異蛋白進行GO功能富集分析，差異蛋白主要涉及生物過程、分子功能和細胞成分。根據含有的差異蛋白數量，選取前30個GO條目，繪制氣泡圖，見圖3。在百草枯中毒早期，差異蛋白主要存在于細胞外區域，主要涉及代謝和應激，而分子功能所涉及的差異蛋白則較少。

2.3??KEGG分析

為明確差異蛋白的主要生化代謝途徑和信號轉導途徑，對差異蛋白進行KEGG分析，結果顯示4種通路的差異蛋白均上調，其中Ko04610（補體和凝血級聯通路）中差異蛋白數量最多，分別為K03990（補體C3）、K01313（凝血因子Ⅱ）、K01315（纖溶酶原）、Kng（激肽原）和K01328（凝血因子Ⅻ）。Ko01210（2-氧代羧酸代謝途徑）富集到2個差異蛋白，分別為K00031（異檸檬酸脫氫酶1）和K00814（丙氨酸轉氨酶）。Ko04080（神經活性配體-受體相互作用途徑）富集到2個差異蛋白，分別為K01315和K01313。Ko05150（金黃色葡萄球菌感染途徑）富集到2個差異蛋白，分別為K01315和K03990，見圖4。

3??討論

4種上調最明顯的蛋白均涉及炎癥反應和促細胞凋亡，特別是差異倍數最高的A0A0G2K9B1，其可減輕炎癥反應并減少細胞凋亡，推測這是機體的一種保護機制[14]。其他3種差異蛋白均可增強炎癥反應并促進纖維化進程[15-16]。研究表明，百草枯進入肺泡上皮細胞后，在氧化應激反應中充當電子載體，主要攻擊細胞的線粒體膜，導致細胞產生炎癥介質，并通過改變線粒體膜電位促使細胞凋亡[2，17]。GO功能富集分析進一步印證上述觀點。KEGG分析提示補體與凝血級聯通路所包含的差異蛋白最多，考慮該途徑受到的影響最大，在百草枯中毒中起主要作用，補體系統是免疫系統的重要組成部分，同時補體系統的激活與炎癥和免疫疾病的發生發展密切相關，補體可通過3條不同的途徑激活：經典途徑、凝集素途徑和替代途徑，3條途徑共同的起始部分為C3的裂解和活化，經激活后產生補體激活產物和膜攻擊復合物[18-19]。近期研究發現，新型冠狀病毒所致肺部感染的患者，其體內的補體系統被過度激活，通過抑制補體可減少血栓形成及減輕急性肺損傷[20]。綜上，筆者推測，C3作為補體級聯通路的關鍵環節，可能在百草枯中毒所致的急性肺損傷中發揮重要作用，如增強炎癥反應及對細胞的損傷，既往有研究表明降低C3表達可明顯抑制肺中性粒細胞浸潤和降低促炎細胞因子水平[21]。

其余三條通路，筆者認為神經活性配體-受體相互作用途徑最有意義。在該途徑中，與激動蛋白酶激活受體（proteinase-activated?receptor，PAR）相關的蛋白顯著上調，PAR共有4種亞型，PAR1作用最為顯著，在急性肺損傷中，補體和凝血級聯系統被激活，同時交叉激活PAR[22-23]。PAR1的激活可介導巨噬細胞/單核細胞的募集、細胞因子的過度釋放和內皮屏障的破壞，增加肺部炎癥反應，PAR1還可通過促進成纖維細胞分化和介導細胞外基質合成進一步增強肺纖維化[24]。研究表明，對敲除PAR1小鼠使用博來霉素誘導肺纖維化，其纖維化程度及肺部炎癥明顯減輕[25]。余下的兩條通路，在百草枯中毒中的作用沒有明確文獻支持，且其中的差異蛋白在其他通路也有表達，推測是匹配算法的機制，故暫不予討論。

通過百草枯中毒小鼠的差異蛋白分析發現，體液免疫、補體和凝血級聯通路的過度激活在百草枯誘導的急性肺損傷的早期發揮關鍵作用，這些通路除增加肺部炎癥損傷外還可導致纖維化的進程發展，即出現急性肺損傷的同時肺纖維化即已經發生，這方面的進一步研究有望為百草枯中毒的治療提供新的策略和方向。

綜上，基于iTRAQ技術在百草枯中毒大鼠中鑒定出84個差異蛋白和4個潛在的信號通路，這些通路及蛋白提示早期急性肺損傷伴隨肺纖維化出現，可能是判斷疾病嚴重程度或制定診療計劃的有價值的標志物。

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