新疆烏什縣綿羊羊蜱蠅巴爾通體檢測及gltA 基因分析

宋浩楠，何 波，李思昂，張 柳，李 正，闕澤偉，趙思雨，武軍元*

（ 1. 塔里木大學動物科學與技術學院，新疆 阿拉爾 843300 ；2. 新疆生產建設兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆阿拉爾 843300 ； 3. 哈密市伊州區動物疫病預防控制中心，新疆 哈密 839099 ）

羊蜱蠅系統學分類可歸納為昆蟲綱、雙翅目、虱蠅總科、虱蠅科、蜱蠅屬。羊蜱蠅通常寄生于宿主的體表，通過吸取宿主的血液維持自身的生命活動，在吸食血液的同時對宿主的造成不同程度損傷[1]。許多研究表明，羊蜱蠅宿主范圍不斷擴大，在許多家養動物和自然野生動物以及人身上均有發現，在多地均有相關報道[2]。羊蜱蠅可傳播多種病原體，國外已報道如藍舌病毒[3]、殺雄菌[4]、巴爾通體[5]、立克次體、綿羊無漿體、錐蟲[6]等，我國已報道的病原體如巴爾通體、立克次體[7]、綿羊無形體[8]、沃爾巴克氏體、包柔氏螺旋體[9]、不動桿菌、希瓦氏菌等。

我國已有多個省份的多種動物均被檢出攜帶巴爾通體，其中包括云南省[10]、廣東省[11]、黑龍江省[12]、新疆維吾爾族自治區[13]等地區的鼠、貓、犬、牛等。近些年，在新疆、西藏、甘肅、四川等地相繼報道了在羊蜱蠅中檢出巴爾通體。何波[14]在新疆阿克蘇庫車市、甘肅武威市等地檢測到巴爾通體，通過巴爾通體gltA基因鑒定，陽性率為95%（103/108），與已知Bartonella melophagi的同源性介于99.3%~100.0%。周賽賽等[15]在西藏林芝、日喀則、那曲地區綿羊羊蜱蠅首次檢測到巴爾通體的存在，鑒定為Bartonella melophagi。向陽等[16]首次在四川省石渠縣綿羊羊蜱蠅中檢測出Bartonella melophagi。目前新疆地區對羊蜱蠅攜帶巴爾通體的研究尚不夠充分、完整，本研究對新疆烏什縣羊蜱蠅感染情況進行檢測，分析羊蜱蠅中攜帶巴爾通體情況和遺傳進化關系，為新疆地區巴爾通體的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2022年3月—5月從烏什縣采集綿羊體表寄生的羊蜱蠅，共獲得羊蜱蠅78只，將所采集的羊蜱蠅分別裝于專用的采樣管中，做好記錄，使其保持存活并帶回實驗室。

1.2 試劑與儀器

Trans2K? DNAMarker（北京天根生化科技有限公司，BM101）、GelStain核酸染料（北京全式金生物技術有限公司，GS101）、DNase/RNase-Free 去離子水（北京天根生化科技有限公司，RT121）、2×Taq Plus PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司，KT205）、血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，DP304-03）等T100 TMThermal Cycler PCR 儀（Bio-rad 公司）、高速離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）、恒溫培養振蕩器（天津歐諾儀器股份有限公司）、全自動凝膠成像分析（ProteinSimple 公司）；電熱恒溫培養箱、數顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）等。

1.3 引物設計

通過檢索有關論文，參照GenBank中所報道的羊蜱蠅18S rRNA基因序列和巴爾通體gltA基因序列設計以下引物，均由江蘇蘇州金唯智生物科技有限公司合成，-20 ℃保存，具體引物序列見表1。

表1 引物序列信息Tab.1 Primer sequence information

1.4 試驗方法

1.4.1 蟲體DNA提取

將所采集的羊蜱蠅樣本依次采用90%、70%、50%、30%、10%濃度的酒精溶液以及蒸餾水為梯度，在37 ℃、250 r/min條件下置搖床中依次沖洗30 min，至蟲體表面污物、雜質基本洗凈。參照中國蠅類以及羊蜱蠅形態學相關文獻[17]，使用體視顯微鏡對所有采集的樣本進行足基節、足轉節、肛溝、氣門板、側溝、生殖孔、基突、須肢等特征部位進行仔細觀察，參照中國蠅類以及羊蜱蠅形態學相關文獻，對羊蜱蠅特征性狀進行鑒別分析。通過體視顯微鏡的觀察，對羊蜱蠅形態進行拍照記錄。

羊蜱蠅經過充分洗滌以及初步形態學鑒定后，放置于1.5 mL EP 管中。具體提取步驟依據DNA 提取試劑盒說明，完成后放置于-20 ℃冰箱保存，作好編號記錄。

1.4.2 PCR擴增

用18S rRNA基因引物以及巴爾通體gltA鑒定引物對提取的羊蜱蠅DNA進行PCR擴增。

18S rRNA PCR反應體系（25 μL）：2×Taq PCR Mix酶為13 μL、上游引物18S-F和下游引物18S-R各1 μL、模板DNA 1 μL，剩余部分用ddH2O補足體系，為9 μL。

反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，38個循環；72 ℃總延伸8 min。

巴爾通體gltAPCR 反應體系（25 μL）：2×Taq PCR Mix 酶為13 μL、上游引物gltA-F 和下游引物gltA-R 各1 μL、模板DNA 1 μL，剩余部分用ddH2O 補足體系，為9 μL。

反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃總延伸5 min。

利用PCR 儀，設置好上述反應條件，試驗過程嚴格保持無菌。PCR 反應結束后，取5 μL PCR 反應產物于1.2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，電泳結束后，凝膠置于全自動凝膠成像分析儀中觀察結果，拍照記錄。

1.4.3 測序及遺傳進化樹構建

將PCR 陽性產物，封口、標記、打包，送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序。測序結果通過NCBI數據庫進行比對，應用MEGA 7.0 軟件建立巴爾通體（Bartonella）系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定結果（見圖1、圖2）

圖1 羊蜱蠅背側Fig.1 Dorsal side of sheep ked

圖2 羊蜱蠅腹側Fig.2 Ventral side of the sheep ked

虱蠅總科包括4個科級階元，分別是舌蠅科、蛛蠅科、蝠蠅科和虱蠅科。這4個科的蠅類均營皮外寄生生活，在寄主體表吸血，寄主范圍廣泛（包括豬馬牛羊、鳥和蝙蝠等），并且專一性高[18]。目前，我國主要發現是虱蠅科、蝠虱蠅科和蛛虱蠅科，其中虱蠅科又包括馬虱蠅屬、利虱蠅屬和蜱蠅屬在內的12屬44種。

舌蠅科以外的3個科，身體均為側扁，便于在寄主體表穿梭，且爪發達，能夠牢牢地抓住寄主。虱蠅的身體通常帶有皮革質感，大多數種類有翅膀。蛛蠅和蝠蠅都形如蜘蛛，頭變得很小，寄生于蝙蝠體表，大多數種類在演化過程中失去了翅膀（除部分蝠蠅外）。

由圖1、圖2 可知，本研究采集的羊蜱蠅體型適中，無翅呈革質，密被細毛。雄性蟲體與雌性蟲體略有差異，雌性成蟲（5.5 mm）略長于雄性成蟲（4.5 mm）。蟲體分3 部分，包括頭、胸和腹；頭部短平闊寬，無單眼，復眼小，觸角短，與胸部連接緊密，胸部不分節，包括3 對足，分別為前足、中足、后足，足末端長有強有力的爪。雌性羊蜱蠅腹部略大于雄性，末端呈凹陷狀；與雌性相比，雄性末端突出。

2.2 18S rRNA 基因和巴爾通體gltA 基因擴增結果（見圖3、圖4）

圖3 羊蜱蠅18S rRNA的PCR結果Fig.3 PCR results of 18S rRNA of Melophagus ovinus

圖4 羊蜱蠅巴爾通體gltA的PCR結果Fig.4 PCR results of gltA of Bartonella of Melophagus ovinus

由圖3、圖4 可知，通過PCR 擴增羊蜱蠅18S rRNA 基因和巴爾通體gltA基因，在1.2%瓊脂糖凝膠電泳，經過紫外線照射并拍攝電泳圖，分別在520 bp和379 bp左右得到與預期大小相符核酸片段。

2.3 序列比對與系統進化樹構建及分析

將羊蜱蠅18S rRNA基因以及巴爾通體gltA基因測序結果，通過NCBI 數據庫進行了Blast 比對，并應用MEGA 7.0軟件建立Bartonella系統進化樹（見圖5）。

圖5 Bartonella gltA基因系統進化樹Fig.5 Bartonella gltA Phylogenetic tree of genes

由圖5可知，所采集的羊蜱蠅中檢出的Bartonella和新疆（MG701233）、美國（AY724768）羊蜱蠅中檢出的參考序列相似性較高，同源性在98.41%~100.00%，可確定本試驗中新疆烏什縣所采集的羊蜱蠅中檢出的巴爾通體為Bartonella melophagi。

3 討論

羊蜱蠅作為繁衍至今的一種古老蟲體物種[19]，其分布范圍隨著生態環境改變、人類生存地遷徙、資源貿易活動愈加頻繁而越來越廣[20]，包括歐洲、非洲西北部、蒙古國等地，但溫度更高的熱帶地區相對不適宜羊蜱蠅存活[21]。目前，非洲、亞洲、澳大利亞和北美洲多數地區也相繼報道了羊蜱蠅的存在[22]。巴爾通體于1855 年被首次報道，在1993年重新分類后，已知有13種與人類疾病有關[23]，可導致人類患貓抓病、卡里翁氏病、多發性盆腔骨髓炎、心內膜炎等多種疾病[24]。

綿羊的品種和年齡是羊蜱蠅在宿主體內移行、宿主間傳播的重要影響因素。羊蜱蠅以母羊為傳播媒介感染羔羊時，以雄性羊蜱蠅更容易被傳播，當羔羊不斷長大以及母羊哺育時間縮短時，羊蜱蠅的轉移數量會下降。此外，羊毛的類型和長度也是決定羊蜱蠅感染的因素之一，羊蜱蠅對羊毛濃密且長的綿羊具有更高的感染率。目前有效的羊蜱蠅防控措施只有綜合性的防控方法，有效、全面地殺蟲滅鼠和消毒滅菌，嚴格檢疫，撲殺患病、帶菌、抗體陽性和隱性感染的動物以清除傳染源，防患于未然。

本研究從新疆烏什縣采集到羊蜱蠅，并檢測到了Bartonella的存在。通過形態學初步鑒定表明，所采集烏什縣綿羊體表寄生的蟲體為羊蜱蠅。烏什縣地處塔里木盆地西北邊緣，氣候溫度適宜羊蜱蠅生長繁衍。隨著生態環境改善，各種人為以及非人為活動的影響，羊蜱蠅的生存環境也受到了較大影響[25]。如今，分子生物學分析能夠更有效地鑒定種間進化關系[26]，其中18S rRNA 基因序列在蠅類分類學研究中已被廣泛應用，且具有高度保守性[27]。通過分析所采集物種18S rRNA 基因序列，可確定其屬于羊蜱蠅。此外，本試驗檢測新疆烏什縣羊蜱蠅中BartonellagltA基因，通過序列比對和建樹分析，發現同新疆庫車市羊蜱蠅中檢測到的Bartonella melophagi（MG701233）相似度極高，在進化樹上聚為一支。由于烏什縣地處南疆，與西藏相距較近，加上新疆、西藏兩地綿羊輸出量較大，更加大了兩地之間通過綿羊攜帶的羊蜱蠅傳播病原的可能性，還需進一步深入研究。

4 結論

本研究采集的物種為羊蜱蠅，運用分子生物學技術闡述了從新疆烏什縣采集的羊蜱蠅體內檢測出的BartonellagltA基因與GenBank 中所提交的中國新疆庫車市的BartonellagltA基因親緣關系較近，并鑒定為Bartonella melophagi。本研究意在提供新疆本土綿羊羊蜱蠅巴爾通體數據支撐，加強對羊蜱蠅的防治，為了解羊蜱蠅中攜帶Bartonella病原的種類以及進化關系提供重要的指導意義與參考價值。