新疆南疆某規模肉牛場牛輪狀病毒G6P[5]型基因型鑒定及分析

趙穎婕，張 偉，冷 婧，王宏圖，胡建軍*

（ 1. 塔里木大學兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆 阿拉爾 843300 ； 2. 塔里木大學動物科學與技術學院，新疆 阿拉爾 843300 ； 3. 阿克蘇西域牧業發展有限責任公司，新疆 阿克蘇 843000 ）

輪狀病毒（BRV）屬于呼腸孤病毒科，為輪狀病毒屬的雙鏈RNA病毒[1]，是導致多種幼齡動物非細菌性腹瀉的主要病原之一。犢牛感染后主要表現特征為腹瀉、酸中毒、四肢無力、精神萎靡，腹瀉嚴重時糞便中含有血絲和脫落的腸黏膜，其中1 周齡犢牛最易感，發病率高達90%~100%，對畜牧業造成嚴重危害。

輪狀病毒屬成員呈正二十面體對稱，直徑約75 nm，三層殼體，無囊膜，基因組由11個節段雙股RNA組成。根據輪狀病毒抗原關系和基因組RNA節段的PAGE電泳圖譜，分為7 個種或血清型，即A~G。根據保護性抗原VP4 和VP7 的免疫原性和基因結構又可分為輪狀病毒血清群分為P基因型和G基因型。A群感染力最強，危害最大；目前已知的G型有34個，P型有50個，國內為G6和G10流行株較多[2]，而且不同基因型之間交叉免疫保護性不強[3]。近年來，新疆南疆地區時有從其他地區大量引入奶牛或肉牛，犢牛腹瀉成為規模化牛場、散養戶常見的犢牛腹瀉疾病。本試驗旨在針對南疆某規模化牛場進行BRV分子流行病學調查，了解該地區BRV流行毒株的基因型，為規模牛場疫病防控劑疫苗研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

BRV檢測試紙條（廣州悅洋生物技術有限公司）、One Step RT-PCR Kit Ver.2.0試劑盒和RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）、反轉錄試劑盒（Thermo Scientific公司）、DMEM 培養基（西安米鼠生物科技有限公司）、MA104細胞（上海富衡生物科技有限公司）、胎牛血清（以色列生物工業有限公司）。

1.2 病料采集及處理

病料為采集自新疆南疆某規模化肉牛場的犢牛腹瀉樣本共5 份，經BRV 抗原檢測卡檢測，其中2 份確定為BRV陽性，-80 ℃冷凍保存。

1.3 引物設計

據參考文獻[4]BRV 特異性引物基因序列，由上海派森諾公司合成，RT-PCR擴增引物見表1。

表1 RT-PCR擴增引物Tab.1 RT-PCR amplification primers

1.4 細胞培養

取細菌濾器處理的牛輪狀病毒陽性樣本上清液于37 ℃用胰蛋白酶處理30 min，并接種于致密單層的MA104 傳代細胞，CO2細胞培養箱37 ℃培養2 h，每隔20 min，取出輕晃一次，最后加入10 mL 維持液，放入CO2培養箱中培養，接毒5 d后收毒，繼續盲傳4~5代，直到產生細胞病變（CPE）。

1.5 RNA提取

出現CPE的細胞培養液按照RNA提取試劑盒說明書操作，提取RNA于-80 ℃冰箱保存。

1.6 BRV的VP7、VP4基因鑒定

采用VP7-F 和VP7-R 的引物擴增蛋白全長基因，以第一次的RT-PCR產物作為第二次RT-PCR的模板，采用VP7-F 與G5-R、G6-R、G8-R、G9-R、G10-R 等引物進行多重半套式PCR 鑒定BRV 的G 型[3]；以VP4-F 和VP4-R特異性引物，擴增其蛋白基因，鑒定其P型。

擴增反應體系（25 μL）：Primescript 1 step Enzyme Mix 0.5 μL，VP7-F 0.5 μL，VP7-R 0.5 μL，模板RNA 2.5 μL，2×1 step Buffer 12.5 μL，RNase Free dH2O 8.5 μL；混勻后瞬時離心5 s。

反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃總延伸10 min。

取擴增產物于1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定[4]。目的條帶純化后送上海派森諾公司測序。

1.7 序列分析

測序序列在GenBank 中進行BLAST 比對分析，下載BRV 參考株的VP7、VP4 部分編碼序列，通過DNASTAR、MEGA 生物軟件對所測序基因序列與參考株進行核苷酸同源性比較，構建VP7、VP4部分基因系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 病毒分離結果

將檢測為陽性的樣品接種到MA104 細胞，其中在第五代出現CPE，主要表現為細胞圓縮、集聚、脫落等。

2.2 RT-PCR鑒定結果（見圖1~圖3）

圖1 BRV VP7基因RT-PCR擴增結果Fig.1 RT-PCR amplification results of BRV VP7 gene

由圖1可知，對細胞培養液樣本提取的RNA產物作為模板，用VP7-F 和VP7-R 作為引物，進行RT-PCR 檢測，結果顯示，擴增出1 062 bp的目的基因片段。

由圖2 可知，以PCR 產物為模板，上游引物為VP7-F,下游引物分別為G5-R、G6-R、G8-R、G9-R、G10-R 進行半套式PCR，其中僅有引物VP7-F/G6-R 擴增出500 bp 大小的目的基因片段。

圖2 BRV VP7基因G型鑒定Fig.2 G-type identification results of BRV VP7 gene positive samples

由圖3可知，以VP4-F和VP4-R為引物擴增出842 bp大小的條帶。

圖3 BRV VP4基因P型鑒定Fig.3 P-type identification results of BRV VP4 gene positive samples

2.3 VP7、VP4基因核苷酸同源性分析（見圖4~圖7）

圖4 BRV VP7基因核苷酸同源性比較Fig.4 Nucleotide homology comparison of BRV VP7 gene

由圖4可知，通過DNAStar軟件對所測序序列與NCBI中13個參考株VP7基因序列進行核苷酸同源性比較，所測序基因核苷酸序列與12個參考毒株的同源性高達90%以上[5]，與參考株MN928482（中國/2020，牛，MN928482.1）和MZ420184（韓國/2020，牛，MZ420184.1）參考株的核苷酸同源性為98.8%。

由圖5可知，BRV VP7與MN928485（G6型）牛輪狀病毒處于同一進化分支。確定該樣本為G6 型牛輪狀病毒，并命名為BRV-MGT-1。

圖5 BRV VP7基因進化樹分析Fig.5 Evolutionary tree analysis of BRV VP7 gene

由圖6 可知，所測序序列與NCBI 中13 個參考株VP4基因序列的核苷酸同源性比較，樣本核苷酸序列與13個參考毒株的同源性高達91%以上，與參考株MN937516（中國/2018，牛，MN937516.1）和MN937515（中國/2018，牛，MN937515.1）參考株的核苷酸同源性分別為97.7%和97.1%。

圖6 BRV VP4基因核苷酸同源性比較Fig.6 Nucleotide homology comparison of BRV VP4 gene

由圖7 可知，BRV-MGT-1 與P[5]型輪狀病毒處于同一進化分支，并與MN937515（P5型）、MN937516（P5型）的核苷酸同源性為97.1%以上[6]。最終確定BRV-MGT-1為G6P[5]型輪狀病毒。

圖7 BRV VP4基因進化樹分析Fig.7 Evolutionary tree analysis of BRV VP4 gene

3 討論

近幾年，新疆南疆地區從其他地區引入大批肉牛、奶牛。BRV是引起新生犢牛腹瀉的重要病原之一，每年因犢牛腹瀉造成嚴重的經濟損失，成為困擾養牛業發展的重要因素。目前，國外流行的BRV 主要的基因型為G6 型、G8 型和G10 型，而我國主要流行G6 型和G10 型BRV[7]。國內多位學者報道了新疆地區牛感染BRV的情況，段新華等[8]對新疆4地區的7個牛場犢牛腹瀉開展流行病學調查，結果表明為A 群BRV 感染。2018 年，陸亞冬等[9]以BRVVP6基因特異性引物，通過RT-PCR檢測到新疆不同地區牛場犢牛存在BRV 感染，且BRV 陽性率較高，達72%。2008 年，常繼濤等[3]報道，新疆部分奶牛場感染的BRV 為G10 型和G6 型。2016 年，張坤等[10]應用雙抗體夾心ELISA、RT-PCR 的方法進行檢測，結果發現，新疆部分地區犢牛感染BRV 的情況極為普遍。2019—2020 年，張迎春等[11]、崔鑫等[12]報道了新疆南疆部分規模牛場犢牛感染的BRV為G10型。

新生犢牛感染BRV所致腹瀉很難通過臨床診斷確診，而根據BRVVP7和VP4的基因差異即可進行基因分型鑒定[13]。本研究通過對新疆南疆某規模肉牛場采集的犢牛腹瀉糞便樣品，經膠體金檢測卡、RT-PCR 擴增VP7、VP4基因的方法進行分型鑒定[14]，確定BRV-MGT-1分離株為G6P[5]型BRV。此外，通過流行病學調查，該規模化肉牛場是新建場，部分牛曾從國內其他省份調入，該場BRV是國內其他地區引入還是當地傳入還需進一步的流行病學調查。通過上述分析可知，新疆地區BRV以G10型、G6型基因型為主，與國內報道一致[11]，本研究結果也豐富了國內犢牛BRV分子流行病學數據庫。

4 結論

目前，BRV呈現多樣化流行趨勢，BRV基因組在自然感染或試驗條件下，可發生多宿主來源的基因重組現象。BRV既可以引起動物病毒性腹瀉，也可感染人。病毒只要在人或動物群體中持續存在就可能導致BRV在易感動物群體中傳播。此外，牲畜交易、調運移動可能導致BRV基因型分布發生變化。因此，對新疆當地犢牛腹瀉開展BRV分子流行病學監測，有利于掌握BRV基因型變遷特征，為BRV疫苗研發提供參考。