犬細小病毒的分離鑒定研究

李鳳艷，陳生雷，劉艷霞，王一平，王 博，舒秀偉

（ 遼寧益康生物股份有限公司，遼寧 遼陽 111000 ）

犬細小病毒病是由犬細小病毒（canine parvovirus，CPV）引起的一種以劇烈嘔吐、出血性腹瀉為主要特征的烈性傳染病，多發于幼年犬，病程快、死亡率高，痊愈犬易患慢性胃腸道疾病，對犬科動物的健康造成嚴重威脅[1]。CPV 為細小病毒科、細小病毒屬、無囊膜的單鏈DNA 病毒，基因組全長5.2 kb，編碼2 種結構蛋白（VP1、VP2）和2種非結構蛋白（NS1、NS2）[2]。其中，VP2蛋白占病毒衣殼的90%，是最主要的保護性抗原，與病毒的致病性和毒力密切相關。CPV對外界的抵抗力很強，對乙醚、氯仿、醇類和去氧膽酸鹽具有抵抗力，其感染性和血凝性均不受影響，對溫度也具有一定耐受性[3]。自1977年CPV被發現以來，該病毒已在世界范圍內廣泛傳播，并迅速出現新基因型毒株CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c。新型毒株在致病力、宿主范圍及流行區域等方面也與原毒株有所差異。目前從不同的國家和地區已分離到3 種亞型，其中CPV-2a 主要在印度、韓國和意大利流行，CPV-2b在越南、日本、美國和歐洲地區流行，CPV-2c 是烏拉圭、意大利的主要流行株。我國主要流行毒株為CPV-2a，南方部分地區以CPV-2b為主[4-6]。CPV變異株不斷出現導致疫苗免疫失敗時常發生，給該病防治帶來了很大困難。預防犬細小病毒病主要的手段是注射犬細小病毒病疫苗，目前國內擁有的CPV弱毒株大多為國外引進。本研究采集一表現輕微腸炎癥狀病犬的病料，在F81細胞上分離出一株中等毒力的CPV毒株，并對該分離毒株進行生物學特性研究，以期為后續開展新型CPV疫苗的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料

試驗于遼寧省某犬場采集出現臨床犬細小病毒病疑似癥狀（發熱、精神沉郁、輕度腹瀉癥狀）的幼犬1例。

1.1.2 細胞

F81細胞購自中國獸醫藥品監察所。

1.1.3 試劑

RPMI Medium 1640、胎牛血清（GIBCO 公司）；Easy Pure Viral DNA/RNA Kit、EasyScript One-Step RT-PCR Super Mix（北京全式金生物技術有限公司）；抗血清由軍事獸醫研究所提供。

引物（F：5'-CTCAGCCACCAACTAAAG-3'，R：5'-GTAAGCCCAATGCTCTAT-3'）由寶生物（大連）有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 病料組織采集及處理

采集CPV病犬腸管l g，按1∶10加入滅菌冷生理鹽水，放入組織攪拌機中，10 000~12 000 r/min充分搗碎組織，充分搗碎組織，反復在-70 ℃以下凍融3次，用3層滅菌紗布過濾2次，收集濾液，并以12 000 r/min、4 ℃離心30 min，收集上清，加入終濃度為1 000 IU/mL 青霉素、1 000 mg/L 鏈霉素，分裝，-80 ℃貯存。

1.2.2 分子生物學鑒定和核苷酸序列分析

利用犬細小病毒VP2基因的特異性引物，采用常規方法對采集的病毒進行PCR鑒定，并將擴增產物送至寶生物（大連）有限公司進行測序，選取GenBank上登錄的CPV參考序列（見表1），使用DNAStar 生物軟件進行核苷酸同源性分析和進化樹構建。

表1 參考毒株信息Tab.1 Information of reference strains

1.2.3 病毒分離

采用F81 細胞，按常規方法消化培養，待傳代分散細胞時同步接入上述處理的病料，同時設不接毒的健康細胞對照。置于37 ℃含5% CO2培養箱培養觀察3~5 d，收獲培養物進行鑒定。

1.2.4 病毒含量測定

將毒種用含8%新生牛血清的RPMI Medium 1640 細胞培養液作10 倍系列稀釋，取10-1~10-8稀釋度，分別同步接種96 孔F81 細胞培養板，每個稀釋度接種8 孔，每孔0.1 mL，同時設正常細胞對照8 孔，置于37 ℃、含5% CO2培養箱培養觀察5 d，根據Reed-Muench 法計算細胞半數感染量（TCID50）。

1.2.5 病毒鑒定

用F81 細胞培養的病毒上清采用常規的磷鎢酸染色后作負染，進行電鏡觀察。

1.2.6 病毒特異性鑒定

分別采用0.1 mL CPV 陽性血清、犬瘟熱病毒（CDV）陽性血清、犬腺病毒（CAV）陽性血清、狂犬病病毒（RV）陽性血清和健康犬陰性血清與病毒分離物0.1 mL在37 ℃中和1 h，同步接種F81細胞。同時設病毒對照和正常細胞對照各6孔，置于37 ℃、含5% CO2培養箱中培養觀察5 d。

1.2.7 病毒回歸試驗

取2~3 月齡CPV 抗體陰性（SN<1:2）的健康幼犬4 只，將病毒培養液稀釋為105.0TCID50/mL，通過口服途徑各接種2.0 mL/d，隔離飼養觀察14 d，同時設置4只不接種對照犬，分別記錄每組犬的臨床表現。

2 結果與分析

2.1 分子生物學鑒定

2.1.1 PCR擴增結果（見圖1）

圖1 PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification results

根據臨床癥狀，初步診斷病犬為CPV感染。

由圖1 可知，利用CPVVP2 基因的特異性引物，通過PCR 擴增，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳得到390 bp 的特異性的核酸片段，與預期片段大小相符，命名為CPV P6株。

2.1.2 病毒核苷酸序列測定和遺傳演化分析（見圖2~圖4）

圖2 核苷酸序列測定結果Fig.2 Nucleotide sequence determination result

利用CPVVP2 基因特異性引物擴增后核苷酸序列測定結果見圖2。

由圖3、圖4 可知，通過生物學軟件DNAstar 進行核苷酸同源性比較和遺傳進化分析，結果表明，分離株與GenBank 上登錄的國內外已發表CPV 參考序列的核苷酸序列同源性最高達99.4%。由遺傳進化樹可知，分離株與2009 年中國分離株GU452715 親緣關系較近，處于同一分支，屬于Subgroup I 亞群，為國內分離株，基因型為CPV-2a。

圖3 分離株與其他毒株同源性比較Fig.3 Homology comparison between the isolate and other strains

圖4 分離株VP2基因遺傳演化樹Fig.4 Genetic evolutionary tree of VP2 gene of isolate

2.2 病毒分離結果（見圖5）

圖5 病毒分離結果Fig.5 Result of virus isolation

采用F81 細胞同步接種CPV 陽性病料的懸液后，第1 代細胞即出現了拉網和脫落的細胞病變（CPE），在此基礎上進一步擴大2代，共培養收集病毒液200 mL。

2.3 病毒含量測定結果（見表2）

表2 病毒含量測定結果Tab.2 Determination result of virus content

由表2可知，第3代分離株病毒經病毒含量測定，根據Reed-Muench法計算TCID50，結果顯示分離株對細胞的半數感染量為105.2TCID50/0.1 mL。

2.4 病毒形態觀察結果（見圖6）

圖6 病毒形態觀察結果Fig.6 Observation results of virus morphology

由圖6 可知，電鏡觀察可見圓形、無囊膜、直徑約20 nm的典型病毒粒子。

2.5 病毒特異性鑒定（見表3）

表3 病毒特異性鑒定結果Tab.3 Result of virus specificity identification

由表3可知，CDV抗血清、CAV抗血清、RV抗血清、陰性血清中和孔和病毒對照孔細胞均出現了拉網、破碎、脫落，CPV 抗血清中和組未出現CPE。結果表明，所分離的病毒為CPV。

2.6 動物回歸試驗

回歸試驗結果顯示，觀察至第5、6 d 時，3 只接種犬先后出現輕微腸炎，并伴有發熱癥狀，病程持續5 d 后康復，對照組4只犬均未發病。

3 討論

CPV屬于細小病毒科細小病毒屬成員，犬細小病毒病臨床可分為腸炎型和心肌炎型。腸炎型自然感染的潛伏期為7~14 d，病初表現發熱、體溫可達40 ℃以上，精神沉郁、不食、嘔吐，初期嘔吐物為食物，之后為黏液狀的黃綠色液體；發病1 d 后開始腹瀉，病初糞便為稀粥狀，隨病程發展糞便呈咖啡色或番茄醬色，腥臭，排便次數不定；病犬可表現眼球下陷，鼻鏡干燥，全身無力，體重明顯下降，同時可見眼結膜蒼白，嚴重貧血，若不及時治療可造成腸內容物毒素吸收導致中毒，出現休克甚至死亡。

CPV在世界范圍內廣泛傳播，不斷有新的變異株被發現，目前我國流行多種亞型的CPV 毒株[7-10]。本研究從遼寧地區腹瀉病犬腸管中分離到一株CPV，通過分子生物學鑒定、病毒分離、電鏡觀察、病毒特異性鑒定和動物回歸試驗等對分離毒株的生物學特性及致病力進行研究，發現該毒株為CPV-2a亞型[11-15]。該分離毒株與2009年中國分離株GU452715具有較高的同源性，且親緣關系最近，處于同一分支，提示該基因型仍為遼寧地區的流行毒株。此外，該分離株與源自日本的AB115504、泰國的GQ379042、意大利的FJ222821等不同CPV亞型毒株在遺傳距離上親緣關系較遠，推測導致不同流行毒株之間差異的重要原因可能與區域環境適應有關。

本研究豐富了我國犬細小病毒病流行病學調查資料及毒種資源，有助于了解本地區CPV 的遺傳變異規律，為后續開展新型CPV疫苗的研制奠定了基礎。

4 結論

本研究成功分離到1 株CPV，分離株與GenBank 上登錄的國內外已發表CPV 參考序列的核苷酸序列同源性最高達99.4%。由遺傳進化樹可知，分離株與2009年中國分離株GU452715 親緣關系較近，處于同一分支，屬于Subgroup I 亞群，為國內分離株，基因型為CPV-2a。該分離株可在F81 細胞上連續傳代，動物回歸試驗結果表明，該毒株為中等毒力毒株。