馬波沙星注射液在牛體內的生物等效性研究

賈 興，王玉欣*，耿智霞，劉 靜，瞿紅穎，宋婷婷，郭李珉，鄧彥宏

（ 1. 河北遠征藥業有限公司，河北 石家莊 050041 ；2. 河北省獸藥技術創新中心，河北 石家莊 050041 ； 3. 吉林大學動物醫學學院，吉林 長春 130000 ）

獸用喹諾酮類藥物包括恩諾沙星、環丙沙星及氧氟沙星等，現廣泛應用于養殖業，多用于治療畜禽由細菌和支原體等引起的疾病，效果明顯[1-3]。近年來，喹諾酮藥物長期使用導致動物產生耐藥性[4-6]。馬波沙星作為第三代喹諾酮類抗菌藥物，是動物專用喹諾酮類抗生素，具有抗菌譜廣、活性強等特點，主要治療由敏感菌引起的母豬子宮炎-乳腺炎-無乳綜合征、牛呼吸道感染和牛泌乳期乳腺炎[7-9]。馬波沙星抗菌譜廣，對革蘭氏陽性菌（特別是葡萄球菌屬）、革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、多殺性巴斯德桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、支氣管敗血性鮑特氏菌屬等）及支原體有效[10]。研究表明，動物注射馬波沙星吸收迅速且完全，血漿蛋白結合率低，在組織中分布廣泛，消除半衰期長，生物利用度接近100%，無明顯生殖毒性。本試驗對兩種馬波沙星注射液在牛體內的藥代動力學參數進行比較及生物等效性分析，為馬波沙星注射液在獸醫臨床中的合理使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗儀器

LC-16 高效液相色譜儀（島津公司）、QUINTIX125D-1CN 電子天平（感量0.000 01 g，德國賽多利斯公司）、H1850R 臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）、XW-80A旋渦混合器（其林貝爾儀器制造有限公司）、ZQZY-CF8軌道式搖床（上海知楚儀器有限公司）。

1.1.2 藥品與試劑

受試馬波沙星注射液（50 mL∶5 g），記為A；參比馬波沙星注射液（100 mL∶10 g），記為R。

超純水（密理博Milli-Q Academic 超純水器）。馬波沙星標準品（含量99.8%，批號H0801511），購自中國獸醫藥品監察所；氧氟沙星標準品（含量99.4%，批號0303-9613），購自中國獸醫藥品監察所。甲醇、乙腈均為色譜純，購自美國Sigma-aldrich公司。甲酸、乙酸、三乙胺均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物

本次臨床試驗以26頭健康成年牛為受試靶動物，體重為600~800 kg，根據農業農村部指導原則設試驗組與對照組兩組，每組12頭；另設2頭空白不給藥動物，能夠滿足法規要求。試驗牛均由吉林省牧碩養殖有限公司提供。

1.2.2 試驗設計

本試驗采用單劑量雙周期兩處理隨機交叉對照盲法設計。清洗期7 d。給藥前，按隨機數從小到大將試驗牛分別標記1~24 號并分為兩組，1~12 號為對照組，13~24 號為試驗組。受試制劑A 與參比制劑R 均采用皮下給藥方式單次給藥，兩種制劑的推薦給藥劑量均為2 mg/kg，每日一次。由給藥人員獨立給藥，1~12 號牛給藥參比制劑R，7 d 后給受試制劑A；13~24 號牛給藥受試制劑A，7 d 后給參比制劑R。

1.2.3 血樣采集

在試驗期內的不同時間點從牛的頸靜脈采血10 mL，置于肝素抗凝采血管中，于-20 ℃保存。具體的采血時間點為：給藥前一次（0 h）及給藥后0.083、0.167、0.250、0.500、0.750、1.000、1.500、2.000、3.000、4.000、6.000、9.000、12.000、16.000、24.000、36.000、48.000 h各一次。

1.2.4 色譜條件

色譜柱：GL Science Inc C18，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動相：pH值3.0、甲酸溶液∶水∶乙腈=76∶9∶15；檢測波長：295 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

1.2.5 方法學驗證

對馬波沙星標準品進行了方法特異性、穩定性、精密度、檢測限和定量限及回收率試驗，考察所建立方法的合理性。

1.2.6 血漿樣品處理

血漿樣品前處理方法參照梅雪潔等[11]的處理方法。從冰箱中取出血漿，解凍并混勻。精密量取0.5 mL樣品到2 mL 離心管中，加入氧氟沙星標準液（內標溶液）振蕩10 min。在4 ℃、15 000 r/min 離心10 min，吸取上清液過濾，精密量取樣品溶液20 μL注入液相色譜儀進行檢測。

1.3 數據統計與分析

采用Data Analysis System（DAS 3.0）軟件對試驗所得到的藥代動力學參數進行分析，SPSS 軟件對藥動學參數進行生物等效性分析。

2 結果與分析

2.1 方法學試驗結果

2.1.1 方法特異性

分析不同來源的空白樣品，馬波沙星和氧氟沙星（內標物）的保留時間附近無雜質干擾。馬波沙星、氧氟沙星與血漿中其他組分分離良好，色譜峰保留時間分別約為9.4、11.2 min（見圖1），方法特異性好。

圖1 不同樣品色譜圖Fig.1 Chromatograms of different samples

2.1.2 定量限和檢測限

以3 倍信噪比（S/N）為方法的檢測限（LOD），測得試驗牛血漿中馬波沙星的LOD為0.05 mg/L。以10倍S/N為方法的定量限（LOQ），測得試驗牛血漿中馬波沙星的LOQ為0.10 mg/L。

2.1.3 線性范圍

血漿中馬波沙星HPLC 測定方法的結果表明，馬波沙星在0.1~5.0 mg/L的濃度范圍內時，方法的線性關系良好，得到標準曲線方程為y=0.998 384x+0.026 646 1，相關系數r=0.999 984 1，大于0.999。

2.1.4 精密度和回收率（見表1）

表1 牛血漿中馬波沙星的回收率和精密度Tab.1 Recovery and precision of marbofloxacin in bovine plasma

檢測結果表明，空白血漿中添加馬波沙星在0.1~5.0 mg/L的濃度范圍內，批內變異系數均小于3.51%，批間變異系數均小于7.18%，精密度良好。空白血漿中馬波沙星的添加濃度為0.1、1.0、5.0 mg/L 時，回收率在92.27%~117.83%之間，回收率穩定。

2.1.5 穩定性

待測藥物馬波沙星在室溫放置24 h 的響應值變異系數低于1.85%，前處理后8、16、24 h馬波沙星響應值的變異系數均低于2.76%，反復凍融3 次后馬波沙星響應值的變異系數低于6.76%，表明穩定性良好。

2.2 牛單劑量注射液A 和R 的實測血藥濃度及藥動學特征（見圖2、表2）

表2 牛單劑量注射制劑A和R后的主要藥動學參數Tab.2 Main pharmacokinetic parameters of cattle after single dose injection of preparation A and R

圖2 牛單劑量注射馬波沙星制劑A與R后血藥濃度-時間曲線Fig.2 Blood concentration-time curve of cattle after single dose infusion of maploxacin preparation A and R

牛以2 mg/kg 劑量單次皮下注射馬波沙星制劑A 和R后，不同時間測得的對應平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

采用DAS 3.0軟件藥代動力學模塊對獲得的A和R的藥-時數據進行非房室模型分析計算藥動學參數，結果見表2。

2.3 生物等效性

采用DAS3.0 軟件生物等效性模塊，根據A 和R 的AUC0-t和AUC0-∞數據，對受試制劑A計算其相對生物利用度，計算結果為：馬波沙星注射液AUC0-t和AUC0-∞的相對生物利用度為103.09%和104.60%；其中AUC0-t參數經生物等效性分析后，A 相比R 的90%置信區間范圍為98.88%~108.31%，在規定范圍內（80%~125%）；AUC0-∞參數經生物等效性分析后，90%置信區間范圍為98.91%~110.15%，在規定范圍內；Cmax參數經生物等效性分析后，90%范圍為80.57%~121.42%，在規定范圍內。

3 討論

馬波沙星動物專用的氟喹諾酮類抗菌藥，主要通過抑制細菌脫氧核糖核酸回旋酶A 亞基的活性而抑制細菌DNA復制、轉錄及蛋白質的合成。由于馬波沙星的抗菌機制特殊，因此與其他抗菌藥很少產生交叉耐藥性[12-13]。

EMEA報道，馬波沙星經口服和注射給藥后均可被很好地吸收，其Cmax和AUC值與劑量成正比；此外，馬波沙星在幾種動物體內分布廣泛，除中樞神經系統外，在其他組織中的藥物濃度均高于血漿，消除半衰期長，生物利用度高，生物利用度均可達到100%[14]。VMD 報道，馬波沙星以2 mg/kg 體重的推薦劑量在牛皮下或肌內注射后，吸收迅速，并在不到1 h內最大血漿濃度達到1.5 mg/L，其生物利用度接近100%。馬波沙星在犢牛體內消除速度較緩慢（消除半衰期為5~9 h），但在牛體內消除較快（消除半衰期為4~7 h）。通過對比表明，本試驗得到的藥代動力學數據與國外報道的數據相差不大。

4 結論

本研究結果表明，牛按照2 mg/kg 的劑量皮下注射馬波沙星注射液的R 和A 后，兩種制劑之間具有生物等效性，可認為兩種制劑具有相似的臨床療效和臨床安全性，均可應用于臨床中牛相關疾病的治療。