腹瀉試驗兔糞便菌群變化的研究

張 江，邢志剛，顧永豪，劉 影*

（ 1. 上海農林職業技術學院，上海 201699 ；2. 上海楚豫生物科技有限公司，上海 201800 ； 3. 上海騰達兔業專業合作社，上海 201415 ）

腹瀉是較常見的家兔消化道疾病，主要表現是糞便不成球、稀軟、呈粥狀或水樣糞便，在不同生長階段均有發生[1]，但以斷乳期幼兔（3月齡以內）發病率最高，也是幼兔死亡的主要原因。若不及時治療易引起大規模發病，不僅影響養兔業的健康發展，也會影響動物試驗及食品安全。家兔腹瀉與腸道微生物菌群失調關系密切，腸道病原微生物會打破正常微生物區系，使有益微生物大量減少，影響家兔腸道健康。導致家兔腹瀉的病原微生物眾多，大多數存在多種病原微生物的混合感染，因此腸道和糞便菌群組成變化可成為腹瀉疾病篩查和確診的客觀指標之一。目前對兔腹瀉病的診斷主要是依靠傳統的細菌學和免疫學診斷方法，即分離培養和生化鑒定，再對疑似菌進行血清學檢測，操作煩瑣費時且陽性率低。而且由于各種細菌培養和鑒定條件不同，單獨檢測的工作量很大，時間較長[2]。本研究以試驗兔為研究對象，采用16S rRNA 基因測序技術，檢測健康試驗兔和腹瀉試驗兔糞便微生物組成及豐度，分析菌群變化，遴選出重要的差異菌群，為試驗兔腹瀉預防、病因學分析及糞菌移植和益生菌干預提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

試驗兔為上海某兔業有限公司飼養的新西蘭白兔，采用疊層式籠養，乳頭式飲水，自動喂料，全自動清糞，按照飼養技術規范配制日糧并進行飼養管理。日糧原料組成包括玉米、麩皮、豆粕、苜蓿草粉、磷酸氫鈣、碳酸鈣、氯化鈣、賴氨酸、蛋氨酸、復合維生素、復合微量元素等，日糧營養水平見表1。

試驗共采集8 只試驗兔糞便，6 只為腹瀉兔，2 只為健康兔。該項研究得到上海農林職業技術學院動物倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑

DNA 提取試劑盒（E.Z.N.A.?Stool DNA Kit, Omega Bio-Tek,Norcross,GA,U.S.）、凝膠回收試劑盒（Axygen Biosciences，Union City，CA，U.S.）、PCR 試劑盒（TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase）。

1.1.3 主要儀器

PCR 儀（ABI GeneAmp?9700 型）、Illumina HiSeq platform測序平臺（上海凌恩生物科技有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 糞便采集

試驗當天于9：30~10：00 采集糞便。操作人員穿防護服，戴手套及口罩，用75%酒精棉球擦拭試驗兔肛門，自然晾干。輕輕按壓兔腹部，用無菌棉簽及5 mL 糞便采集管接取糞便3~5 g。擰緊管蓋，做好標記，立即置于冰上。糞便樣品運至實驗室后，-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 16S rRNA基因測序

按照E.Z.N.A.?Stool DNA Kit說明書提取糞便DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA。PCR 擴增16S rRNA 基因V3~V4 段，引物序列（341F：5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'；806R：5'-GGACTACNNGGGTWTCTAAT-3'）。

PCR 反應程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 30 s，25個循環；72 ℃ 5 min。

PCR 反應體系（20 μL）：5×FastPfu 緩沖液4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、引物（5 μmol/L）0.8 μL、FastPfu聚合酶0.4 μL、模板DNA 10 ng。

采用2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物，按照AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒說明書回收PCR 產物。構建Illumina PE250文庫并測序。

1.2.3 生物信息學分析

使用FLASH軟件對序列進行拼接，利用qiime軟件對序列質量進行質控過濾。采用RDP classifier 貝葉斯算法對97%相似水平的OTU 代表序列進行分類學分析，并分別在各個分類水平統計各樣本的群落組成。基于OTU聚類結果分析OTU多樣性指數。利用Mothur（v.1.30.1）進行α多樣性分析。采用單因素方差分析（ANOVA）、Wilcoxon秩和檢驗及LDA分析進行菌群差異分析。

2 結果與分析

2.1 試驗兔腹瀉臨床癥狀

試驗兔腹瀉多發生于春秋兩季，患病率接近1%。試驗兔腹瀉發病急，從發病到死亡僅2周左右時間，具體癥狀見表2。

表2 試驗兔腹瀉臨床癥狀Tab.2 Clinical symptoms of diarrhea in experimental rabbits

2.2 16S rRNA基因測序結果（見表3）

表3 16S rRNA基因測序結果Tab.3 Results of 16S rRNA gene sequencing單位：個

測序結果顯示得到369 888 個有效序列，平均長度為416 bp。將相似性達到97%的有效序列歸為一類，即1個OTU。

由表3 可知，與健康兔相比，腹瀉晚期序列數及OTU數均顯著下降（P<0.05）。

2.3 腹瀉對試驗兔糞便菌群α多樣性的影響（見表4）

表4 腹瀉對試驗兔糞便菌群α多樣性的影響Tab.4 Effect of diarrhea on α-diversity of fecal microbiota in experimental rabbits

由表4可知，腹瀉使兔糞便樣本序列數均有所減少，但腹瀉晚期兔糞便樣本序列數最少。與健康試驗兔相比，腹瀉試驗兔糞便樣本的Shannon指數及Chao1指數均有所下降，腹瀉晚期的Shannon指數及Chao1指數最小；腹瀉試驗兔的Simpson指數升高，腹瀉晚期Simpson指數最大。

與健康試驗兔的糞便相比，腹瀉晚期試驗兔糞便的Chao1 指數、Shannon 指數及Simpson 指數均顯著降低（P<0.05）。

2.4 腹瀉對試驗兔糞便優勢菌群的影響（見表5）

表5 腹瀉對試驗兔糞便優勢菌群的影響Tab.5 Effect of diarrhea on dominant fecal flora of experimental rabbits單位：%

試驗共檢測到14 個門、21 個綱、53 個目、97 個科及217個屬。

由表5可知，在門、綱、目水平，腹瀉兔糞便的優勢菌群和健康兔基本一致，但腹瀉兔糞便變形菌門（Proteobacteria）、γ變形桿菌綱（Gammaproteobacteria）及擬桿菌目（Bacteroidales）豐度顯著升高；厚壁菌門（Firmicutes）、梭狀芽孢桿菌綱（Clostridia）、顫螺目（Oscillospirales）及毛螺目（Lachnospirales）豐度均明顯減少。在科和屬水平，腹瀉兔腸桿菌科（Enterobacteriaceae）及埃希氏-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）豐度均明顯升高，躍居為第一優勢科和第一優勢屬。毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）及瘤胃球菌屬（Ruminococcus）豐度下降最多。

2.5 腹瀉試驗兔與健康試驗兔糞便菌群的差異分析（見圖1）

圖1 糞便微生物菌群的LDA分析Fig.1 LDA analysis of fecal microbial flora

采用ANOVA 方差分析（F檢驗），腹瀉兔和健康兔糞便中有309 個OTUs 在存在顯著差異（P<0.05），250 個OTUs存在極顯著差異（P<0.01）。利用Wilcoxon秩和檢驗分析發現，腹瀉兔和健康兔糞便有3個屬存在極顯著差異（P<0.01），19 個屬存在顯著差異（P<0.05），其中只有埃希氏-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）在腹瀉兔糞便中的豐度高于健康兔。

由圖1 可知，通過LDA 分析發現，健康兔和腹瀉兔的菌群豐度存在顯著差異（P<0.05），并且LDA 值大于2.4 的菌群有38個，其中腹瀉試驗兔糞便中有5個顯著差異菌群（LDA>3.6），分別為腸桿菌目（Enterobacterales）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、埃希氏-志賀氏菌（Escherichia-Shigella）、Tissierellales菌及亨得特拉菌（Hungatella）。

3 討論

本研究結果顯示，腹瀉晚期試驗兔糞便的OTU數顯著下降，糞便菌群α 多樣性指數顯著降低，表明腹瀉試驗兔糞便微生物群落多樣性顯著下降。腹瀉試驗兔與健康試驗兔的糞便菌群存在顯著差異，表明腹瀉兔糞便菌群嚴重失調。有研究表明，腸道菌群失調是誘發腸炎的重要因素[3]。

本研究中，腹瀉試驗兔糞便厚壁菌門和該門下的梭狀芽孢桿菌綱、顫螺目、毛螺目及瘤胃球菌屬豐度減少。厚壁菌門是兔腸道的優勢菌門[4]，其中多數菌群是有益菌，這些有益微生物在代謝過程產生短鏈脂肪酸[5]。短鏈脂肪酸能夠修復受損腸黏膜，維持腸上皮完整，促進抗炎因子分泌及腸道免疫反應，抑制有害菌生長，恢復菌群平衡，減少腸炎發生[6]。健康菌群不利于致病菌在腸道中定植[7]，健康菌群豐度下降，致病菌定植增加，使腸黏膜生物屏障功能下降，腸黏液層破裂導致腸道細菌入侵，最終引起腸道炎癥[8]。因此，為改善試驗兔腸道健康，可將厚壁菌門、梭狀芽孢桿菌綱、顫螺目、毛螺目、毛螺旋菌科、瘤胃球菌科及瘤胃球菌屬作為糞菌移植的備選菌群。

本研究中，腹瀉兔糞便中擬桿菌門、擬桿菌綱及擬桿菌目豐度升高。有研究指出，擬桿菌門豐度與炎性因子（白細胞介素-1β）水平呈正相關[9-10]，結腸炎大鼠脆弱擬桿菌豐度升高[11]。變形菌門是胃腸道中一類適應性強、具有潛在致病性的常見菌，其豐度變化直接影響宿主健康[12]。有研究表明，結腸炎小鼠變形菌門豐度升高[13]。本研究中，腹瀉兔糞便變形菌門、γ 變形桿菌綱、腸桿菌科及埃希氏-志賀氏菌屬豐度顯著升高。Song 等[11]研究發現，潰瘍性結腸炎大鼠中大腸桿菌豐度升高，結果與本研究一致。埃希氏-志賀氏菌及亨蓋特拉菌是眾所周知的致病菌，屬于條件致病菌，能夠破壞腸道屏障，引發炎癥[14]。厚壁菌門的Tissierellales 菌可生產乙酸鹽[15]，乙酸鹽可影響腸道菌群平衡[16]。本研究結果顯示，基于LDA 分析，可考慮將腸桿菌目、腸桿菌科、埃希氏-志賀氏菌、Tissierellales菌及亨蓋特拉菌作為試驗兔腹瀉生物標記的備選菌群。

4 結論

本研究結果表明，腹瀉兔糞便菌群多樣性下降。健康兔與腹瀉兔糞便微生物菌群組成存在顯著差異，厚壁菌門、梭狀芽孢桿菌綱、顫螺目、毛螺目、毛螺旋菌科、瘤胃球菌科及瘤胃球菌屬豐度明顯下降，可考慮作為改善家兔腸道健康的備選菌群；腹瀉兔糞便中腸桿菌目、腸桿菌科、埃希氏-志賀氏菌、Tissierellales菌及亨蓋特拉菌的豐度顯著高于健康兔，可考慮作為試驗兔腹瀉生物標記的備選菌群。本研究結果可為試驗兔腹瀉病預防和病因學分析提供參考。