Hoxc13 基因在灘羊羔羊不同生長時期皮膚組織的表達分析

田進陽，馬麗娜，馬 青*

（ 1. 寧夏回族自治區灘羊選育場，寧夏 吳忠 7511002 ；2. 寧夏農林科學院動物科學研究所，寧夏 銀川 750002 ）

灘羊是我國地方裘皮用綿羊品種，“二毛皮”更是久負盛名，享譽海內外?！岸ぁ笔侵冈跒┭蚋嵫虺錾?5日齡左右，毛長達8~9 cm時宰殺所剝取的毛皮，具有非常高的經濟價值。但二毛期過后，毛股隨著日齡的增長而變粗變長，這種優良的二毛裘皮性狀逐漸消失，毛股變得松散，花穗亦欠美觀[1]。

作為同源異型盒（homeobox，Hox）基因家族Abd-B類成員，Hoxc13基因在毛囊形成和毛發生長方面具有重要作用，可緊密調控角蛋白基因角蛋白（KP）和角蛋白關聯蛋白（KAP）的表達。有研究表明，毛發的物理特性會受到Hoxc13 基因在皮膚組織中表達量的影響[2]?；谇捌谘芯堪l現，Hoxc13 基因基因型CT 個體對毛長具有顯著影響，可作為灘羊二毛性狀分子標記輔助選育的關鍵基因[3]。為此，本試驗利用qRT-PCR 分析Hoxc13基因在灘羊羔羊不同時期皮膚組織中的表達水平，為解析Hoxc13 基因在灘羊不同生長時期毛皮發育調控的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集35、55 日齡灘羊羔羊的皮膚組織，每個日齡各取10只羊，樣品大小約1 cm2，采集部位均為左側肩胛骨后緣處，液氮保存。試驗動物均來自寧夏鹽池灘羊選育場。

1.2 引物設計及合成

根據GenBank 公布的綿羊Hoxc13 基因序列和18S rRNA基因序列，采用Primer5.0設計引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3 RNA提取

利用總RNA提取試劑盒（批號：DP419，天根生化科技（北京）有限公司）進行灘羊皮膚組織RNA提取，操作方法參考試劑盒說明書。提取的總RNA 通過1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計進行檢測。

1.4 Hoxc13基因Real-Time PCR檢測

1.4.1 反轉錄

用反轉錄試劑盒TIANScript RT KIT（批號：KR107，天根生化科技（北京）有限公司）進行反轉錄，參照說明書對所提取的RNA進行反轉錄，合成cDNA第一鏈，進行10倍稀釋，-20 ℃保存。

1.4.2Hoxc13基因Real-Time PCR檢測

取2 μL 稀釋的樣品cDNA 作模板，分別用Hoxc13 基因基因引物和內參基因引物進行擴增。同時在60~95 ℃溫度條件下進行溶解曲線分析，每個樣品cDNA重復檢測3次。

1.4.3Hoxc13基因Real-Time PCR反應體系與程序

擴增程序：95 ℃ 15 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃30 s，45個循環。

反應體系：2×Super Real PreMixPlus 10 μL、上游引物（10 μmol/L）0.6 μL、下游引物（10 μmol/L）0.6 μL、cDNA 1μL、50×ROX Reference Dy 0.4 μL，加入滅菌純化水至20 μL。

1.5 數據統計與分析

運用SYBR Green Ⅱ染料實時熒光定量PCR的方法進行驗證。試驗采用2-△△Ct法對35、55日齡灘羊的皮膚組織中Hoxc13 基因mRNA 的相對定量計算。試驗數據采用Excel 2010軟件進行整理，SAS 8.2軟件進行統計分析。結果以“平均值±標準差”表示，P<0.01 表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 RNA提取結果（見圖1）

圖1 RNA提取結果Fig.1 RNA extraction result

由圖1 可知，提取的總RNA 通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，28S、18S 和5S 處均有條帶，其中5S 帶較淺，表明RNA 無明顯降解。同時利用紫外分光光度計檢測，OD260nm/OD280nm比值為1.8~2.0，表明RNA純度較高。

2.2 Hoxc13基因Real-Time PCR檢測結果（見圖2~圖4）

圖2 內參基因18S rRNA實時擴增曲線及產物溶解曲線Fig.2 Reference gene 18S rRNA real-time amplification curve and product dissolution curve

由圖2可知，在內參基因18S rRNA擴增曲線中總熒光強度在25 個循環左右開始趨于平緩，溶解曲線的峰值在80 ℃以上，有且只有1個峰。

不同生長時期Hoxc13 基因擴增曲線及溶解曲線見圖3、圖4。

圖3 35日齡灘羊皮膚組織中Hoxc13基因擴增曲線及溶解曲線Fig.3 Amplification and dissolution curves of Hoxc13 gene in 35 days of age of Tan sheep skin

圖4 55日齡灘羊皮膚組織中Hoxc13基因擴增曲線及溶解曲線Fig.4 Amplification and dissolution curves of Hoxc13 gene in 55 days of age of Tan sheep skin

由圖3、圖4 可知，35 日齡和55 日齡灘羊皮膚Hoxc13基因溶解曲線的峰值均在80 ℃以上，有且只有1個峰。

2.3 不同時期灘羊皮膚組織中Hoxc13 基因的表達量（見表2）

表2 不同時期灘羊皮膚組織中Hoxc13基因的表達量Tab.2 Expression of Hoxc13 gene in skin tissue of Tan sheep at different periods

由表2可知，55日齡灘羊皮膚組織中Hoxc13基因的表達量極顯著高于35日齡灘羊的皮膚組織（P<0.01）。

3 討論

近年來，許多學者集中于研究特定基因的表達在毛囊發生、發育過程中的調控作用。Hoxc13基因在控制毛發形成方面起到重要作用[2]。Wu等[4]研究發現，在胚胎發育過程中，Hoxc13基因表達量與皮膚中毛囊形態形成具有相同的變化趨勢。趙志東等[5]研究發現，在絨毛周期性生長過程中，KAP9.2基因可抑制絨毛生長，Hoxc13基因則會影響KAP9.2 基因的表達。也有研究發現，蘇博美利奴羊各組織器官中均有Hoxc13 基因表達，在皮膚中的表達量高于肌肉、腎臟、心臟、脾臟、肺臟和肝臟組織，認為Hoxc13 基因可能與毛囊發育的過程相關[6]。Wu 等[7]研究發現，Hoxc13/β-catenin基因與卵泡活性相關，7 月到11 月間Hoxc13 基因的表達量急劇增加，Hoxc13 基因的過表達降低了對毛囊具有負作用的HFDRGs 的表達量，因此認為Hoxc13基因對毛囊發育具有積極作用。

在毛囊生長發育過程中，角蛋白和角蛋白關聯蛋白調控相關細胞的生長發育、分化、遷移、增殖和凋亡，Hoxc13基因通過控制角蛋白和角蛋白關聯蛋白進而控制哺乳動物的毛發性狀[8]。灘羊胚胎期毛囊與毛纖維發育相關基因的表達與調控造就了灘羊二毛期的毛皮特性[9]。雒志新[10]研究發現，Hoxc13 轉錄因子Hoxc13 對KRT38、KRT84 基因為正調控，對KRT1基因為負調控。在絨山羊胎兒時期，Hoxc13基因的表達量隨著胎兒皮膚厚度的增加而增加；在成年絨山羊皮膚中，Hoxc13基因的表達量與次級毛囊活性變化趨勢一致。在哺乳動物被毛發育過程中，Hoxc13基因作用發生了適應性進化，且在絨山羊皮膚毛囊形態及周期性生長過程中具有重要作用[11]。Hoxc13 基因在出生后兩周的絨山羊羔羊皮膚中的表達量遠高于70 d 胚胎[12]。研究發現，西藏絨山羊Hoxc13基因的CDS序列遺傳保守型，僅在第1外顯子發現1個錯義突變和2個同義突變[13]。

4 結論

本研究結果顯示，35、55 日齡灘羊羔羊皮膚組織中均有Hoxc13 基因表達，且在55 日齡灘羊皮膚中的表達量極顯著高于35 日齡灘羊的皮膚組織，推測Hoxc13 基因可能與毛囊發育的過程密切相關。