局部涂抹及口服膠原蛋白肽在皮膚年輕化中的研究進展

于瀟宇，琚婧儀，李相懿，張姝，李嘉倫

（1.華中科技大學附屬武漢協和醫院，湖北，武漢，430000 2.武漢皮可力醫療美容診所，湖北，武漢，430000）

作為人體最大的器官，皮膚是由表皮、真皮層、皮下層三部分構成的。皮膚內源性老化和外源性老化共同決定皮膚的老化進程，這一過程是長期的、高度異質性的。內源性老化是由時間進程決定的，難以避免。其主要由人體自身機制調控，特征是皮膚變薄和細紋產生[1]。內源性老化也是一種氧化過程，這與年齡相關性的皮膚抗氧化能力下降和活性氧（ROS）生成增多有關[2]。外源性老化主要取決于暴露于環境因素的強度和持續時間以及皮膚類型，例如空氣污染、吸煙、營養不良和紫外線（UV）光等。隨著單細胞測序技術的發展，皮膚老化的分子機制愈發明確，與生長發育有關的轉錄因子下調是皮膚衰老的重要特征[3]。除了細胞內的變化，細胞外基質（ECM）在內源性和外源性的老化皮膚中也表現出結構和功能的變化，其中膠原蛋白的含量顯著減少[4]。

構成皮膚組織的蛋白質成分主要是膠原蛋白[5]。CP是一種線性或環狀聚合物（相對分子質量＜3000），主要由水解膠原蛋白組成。CP具有多種生理功能，包括改善皮膚衰老、防止骨質疏松和預防Ⅱ型糖尿病等方面的功能[6]。本文主要關注CP改善皮膚衰老的功能。許多關于CP的體外實驗、動物實驗和細胞實驗結果都已表明，CP在延緩皮膚自然衰老和抑制紫外線引起的光損傷方面具有良好效果[7]。此外，許多臨床試驗表明，CP能夠有效改善人體皮膚彈性、減少皺紋[8]。不同于現存的相關綜述，本文主要介紹局部涂抹CP的抗氧化、抗糖化、抗炎作用，并與口服CP的作用相比對。二者作用機制不同，但可以起到協同改善皮膚老化作用。

1 CP 概述

CP有廣泛的物質來源，包括豬，牛，水產（主要是魚類），羊，家禽[9-11]等。我國海洋資源豐富，值得更廣泛關注的是水產動物源CP。膠原蛋白是以Gly-X-Y重復序列為特征的三螺旋結構（見圖1），由約20種氨基酸組成。CP是膠原蛋白水解后形成的一種介于蛋白質和氨基酸之間的分子質量混合物，通常是幾百到幾千的分子量[12]。CP中含有羥基脯氨酸和羥基賴氨酸，對多肽的連接和膠原的穩定具有重要作用[6]。CP主要有以下三種獲取方式：從天然生物體中提取，化學合成與重組DNA技術，水解體外膠原蛋白[13]。目前，主流的CP制備方法是體外膠原蛋白水解法，即將分子量較大的膠原蛋白水解為分子量較小的多肽。水解體外膠原蛋白法步驟主要有：原料預處理，膠原蛋白提取，膠原水解[14]。

圖1 膠原纖維組成和結構

2 局部涂抹應用

2.1 皮膚抗氧化作用

皮膚內源性老化存在氧化應激。這與線粒體滲漏、炎癥等增加活性氧（ROS）的產生，以及年齡相關的細胞修復能力下降有關[15]。UVB誘導的光老化與ROS的生成增多密切相關。皮膚老化過程中增多的ROS激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，誘導激活蛋白-1（AP-1）和核因子-Kb（NF-κB），抑制基質金屬蛋白酶（MMP）的表達，促進皮膚膠原蛋白的降解；抑制轉化生長因子-β（TGF-β）信號通路，抑制皮膚膠原蛋白的合成（見圖2）[16-19]。此外，UV照射引起的小鼠氧化應激指標發生異常改變，如降低超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的水平，增加脂質過氧化物（LPO）和丙二醛（MDA）的水平，并觸發8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）的形成[20]。CP是一種常見的抗氧化劑。這種低分子量蛋白質因其優良的生物相容性、易降解性和較弱的抗原性而被廣泛應用。CP通過清除自由基、中斷脂質過氧化的自由基鏈來發揮抗氧化作用[21]。其抗氧化機制尚未完全闡明。據報道，CP的抗氧化效力與CP中的疏水性氨基酸有關[22]。這可能是CP的抗氧化活性位點與自由基結合的空間位阻不同造成的[23]。

圖2 皮膚老化的分子機制

Bang等[19]人利用水解牡蠣蛋白制備的CP局部涂抹在UVB照射的無毛小鼠的皮膚上。實驗組小鼠的皺紋長度、深度和表皮厚度得到明顯改善，體內因UVB照射而降低的抗氧化酶活性得到恢復并調節了促炎細胞因子的表達。Qin等[24]將大馬哈魚魚皮來源的CP局部涂抹在UVB照射后的大鼠無毛背部皮膚，可增加皮膚抗氧化酶（GSH和SOD）含量，這有效對抗衰老。其中平均分子量為1194.00道爾頓的CP效果最好。鰱魚骨來源的CP具有減少ROS生成的能力，并使脂質過氧化自由基鏈中斷，呈劑量依賴性的作用[25]。體外實驗顯示，它對纖維細胞和角質細胞有較好的光線保護的效果。值得注意的是，經過鰱魚骨CP處理的炎性巨噬細胞釋放炎性細胞因子減少，尤其是腫瘤壞死因子-α（TNF-α）。但CP的抗氧化作用的具體機理還有待明確，這可能與它降低ROS生成，中斷過氧化自由基鏈有關，也可能與它增加抗氧化酶含量有關。

2.2 皮膚抗糖化作用

糖化被視為肌膚加速衰老的關鍵因素，特別是暴露于紫外線中的皮膚。蛋白、脂質、核酸等大分子與葡萄糖或其他還原單糖反應生成晚期糖基化終末產物（AGEs）。AGES與皮膚的衰老有著密不可分的聯系。AGEs直接或間接結合各種細胞表面的AGE特異性受體（RAGE），激活NF-κB和MAPK信號通路，增加MMP的產生[26]，并誘導細胞內ROS[27]和炎性細胞因子的產生[28]。UV通過促進生成AGEs，可使皮膚的糖化程度加劇，釋放出大量的活性氧自由基，從而產生氧化應激狀態[29]。第二，膠原蛋白由于更新速度慢，更容易發生糖化。AGES在皮膚老化的過程中修飾膠原蛋白，會影響膠原蛋白纖維結構力學功能的完整性，和ECM對MMP介導組織的重塑的敏感性[30]。

局部涂抹CP通過抑制AGEs的積累來對抗皮膚的糖基化進程。據報道，Lee等[31]在一項由22名亞洲女性參與、為期4周的前瞻性單臂研究中發現，局部CP應用后，第4周觀察到皮膚皺紋、彈性和密度明顯改善，皮膚AGEs積累減少，無不良影響。體外研究表明，成人真皮纖維細胞受紫外線照射，經CP處理后，兩種主要的AGEs生物標志物戊糖苷和甲基乙二醛的含量明顯減少[31]。抑制AGEs的機理主要包括3個方面，一是抑制其生成；二是斷裂交聯結構；三是阻斷其與受體結合，其中最有效的是抑制AGEs生成，從源頭上解決問題。CP抗糖化的機理仍有待進一步闡明。盡管已經生成的AGEs很難被清除，但是通過局部涂抹應用CP，能有效抑制AGEs積累，從而實現皮膚的抗老化。

2.2 抗炎作用

皮膚的內在老化涉及慢性低度炎癥。老化皮膚中的衰老細胞對皮膚慢性炎癥的驅動有著舉足輕重的作用。由于它們的分泌譜與年輕的細胞相比發生了改變，因此被稱為衰老相關的分泌表型（SASP）。其分泌譜主要變化有促炎性細胞因子、趨化因子、蛋白酶和生長因子等[32]。有可靠的證據顯示，促炎型衰老細胞在許多組織中隨著衰老而增強慢性低級別炎癥。這種狀態叫作炎癥性衰老（Inflammaging）[33]。

皮膚中SASP的發展是包括免疫細胞在內的細胞成分之間相互作用的結果。老化的皮膚中，朗格漢斯細胞（LCs）的數量下降，遷移能力也較差[34]。CD4+Foxp3+調節性T細胞的抑制干擾皮膚的免疫監視能力[35]。皮膚駐留的巨噬細胞也表現出向促炎癥表型的轉變，這促進了進一步的組織炎癥[36]。這些免疫細胞是否參與衰老細胞的持續存在尚未明確。

Salminen等[37]認為由紫外線輻射或其他一些損傷引起的持續炎癥狀態會刺激免疫抑制并促進過早衰老。UVR照射會造成皮膚DNA和ECM的損傷，產生ROS，促進氧化應激，引起炎癥反應。炎癥刺激皮膚免疫抑制細胞增殖，從而拮抗炎癥，但是這又會引發皮膚的免疫抑制狀態。免疫抑制細胞分泌抗炎細胞因子（IL-10和TGF-β）,減少真皮脂肪組織[38]，促進細胞衰老并擾亂ECM的結構。皮膚的免疫抑制狀態會對發炎組織中的免疫細胞和非免疫細胞產生有害影響[39]。UVR-炎癥-免疫抑制通路的激活增加了衰老細胞在受影響組織中的積累，衰老細胞表達SASP，推動皮膚的病理改變[40]。

體外研究實驗表明，遮目魚鱗片中分離的膠原肽不僅具有抗氧化和DNA保護活性，還通過降低脂氧合酶活性、一氧化氮（NO·）自由基等作用而表現出抗炎作用[41]。Peng等[42]局部應用水解牡蠣蛋白來源的CP在皮膚上，通過多種機制顯著減輕了慢性UVB照射引起的皮膚膠原蛋白的流失。抗氧化方面，促進了抗氧化酶（SOD和GPH-Px）的活性，同時降低了皮膚中的丙二醛（MDA）水平。抗炎方面，抑制了炎癥細胞因子（IL-6、TNF-α）和炎癥相關蛋白（iNOS、COX-2）的表達。抗膠原蛋白降解方面，CP抑制金屬蛋白酶1（MMP1）的表達。

3 口服CP 改善皮膚水合作用

在社交平臺上，口服CP被宣傳可以通過增加真皮膠原蛋白、透明質酸和皮膚的水含量來逆轉皮膚老化的臨床癥狀。近幾年來，消費者對于口服CP的熱情逐年上漲[43]?？诜zCP具有改善皮膚水合作用已被多項動物實驗、臨床試驗證實有效。Kang等[44]研究顯示，無毛小鼠口服CP后，皮膚皺紋得到改善。同時，改善水合作用，合成透明質酸的透明質酸合成酶表達上調；抑制水合作用，分解透明質酸的透明質酸酶表達下調。口服低分子量CP可以作為一種保健功能食品成分來改善人體皮膚的水合作用、彈性和皺紋。一項隨機、三盲、安慰劑對照研究表明，口服CP12周后，實驗組皮膚整體水合度、皮膚彈性較安慰劑組有明顯改善[45]。口服CP不僅可以美容養顏，還可以增強老年人皮膚機械性能。另一項臨床研究顯示，39名65歲或以上住院患者中，每天口服1次含有CP的營養補充劑（10.0g）的患者，比對照組角質層水化度和皮膚彈性改善明顯，這樣可以幫助減少老年人皮膚的脆弱性[46]。Kim等[47]進行了隨機、雙盲、安慰劑的對照試驗，給予每日1000mg低分子量鲇魚皮CP的女性比安慰劑組女性皮膚水化值更高，皮膚彈性更好，皺紋更少?？诜桇~皮CP顯著增加皮膚HYP、透明質酸、水分含量，提高血清及皮膚抗氧化酶SOD及CAT的活性[48]。一項針對34名40-65歲健康女性進行的為期12周的臨床試驗表明[49]，實驗組通過服用以水溶性輔酶Q10和膠原蛋白結合為特征的液態食物補充劑，使真皮層密度得到改善，眼眶周圍皺紋面積和皺紋總評分減少，皮膚光滑度得到改善。而皮膚的滋潤度、真皮層的厚度、失去經皮的滋潤度（TEWL）以及黏性彈性等方面的變化，則沒有明顯的差別。這可能是因為攝取的食物補充劑是膠原蛋白，分子較大，而非CP。

4 膠原蛋白肽目前應用的局限性和展望

4.1 提高CP 的生物利用度

局部涂抹CP和口服CP可以促進皮膚膠原蛋白的生成、抑制老化引起的膠原蛋白的降解。二者既有區別，也有聯系。從CP吸收方式上來講，口服CP在小腸被吸收，進入血液循環。有證據表明，進入血液循環的功能性肽可以轉移到皮膚上，并代謝發揮作用[50]。CP經皮主要通過角質層、毛囊、汗管及皮脂腺4條途徑吸收而不進入體循環，其中后3 者常被稱為旁路途徑[51]。局部涂抹CP很重要的一個問題，就是滲透到真皮里面的滲透性比較低。皮膚外層的滲透取決于不同的因素，如：物質（分子大小，穩定性，結合性，溶解性）的物理化學性質不同，穿透的時間刻度，皮膚的厚度與成分，皮膚新陳代謝，皮膚的部位、區域和應用持續時間特點，透皮裝置[52]。研究表明，一些合適的參數能夠增強并保證皮膚上局部產品的傳遞。這些參數與小于500da的分子量、介于1和3之間的辛醇/水分配系數、小于200°C的熔點、＞1mg/mL的水溶解度以及極少的極性中心有關[53]。角質層通常被認為是一種實體結構，采用積極的繞過角質細胞的方法來遞送CP是值得期待的。包括：微針陣列，角質層消融，電輔助方法（超聲，離子滲透療法，電穿孔等）[51]。與一般的口服藥物遞送系統不同，局部應用CP不需要經皮滲透入血，因此提高CP透皮吸收效率和皮膚停留時間是有廣泛應用前景的。

4.2 CP 具體生物活性成分的鑒定

CP作為皮膚抗老化的營養品、化妝品已被廣泛應用，但其中具體的抗老化生物活性成分卻有待更深層次的考察。Pro-Hyp和Hyp-Gly二肽在成纖維細胞的增殖中起重要作用[54]。口服含Pro-Hyp和Hyp-Gly更多的CP，能更好地提高皮膚水合度、減少皺紋、增加皮膚彈性[55]。值得注意的是，兩種CP對成纖維細胞有趨化作用，Pro-Hyp可以促進成纖維細胞合成HA。魚鱗制備的CP，在體內以雙肽形式（Gly-Pro和Pro-Hyp）吸收，降低了皮膚中MMP-1的產生，增加了成纖維細胞中1型前膠原的合成，對UVB誘導的體內光老化的起保護作用[56]。Liu等[57]收集了口服后含膠原肽（CPS）的血清和從血清代謝物（SCP）中分離的膠原肽，SCP通過激活TGF-β/SMAD通路來促進膠原合成。抑制AP-1、MMP1和MMP3蛋白表達抑制膠原蛋白降解，從而起到修護效果。值得注意的是，血清代謝物中的IO（Ile-Hyp）和AOG（Ala-Hyp-Gly）兩種肽段被鑒定為通過激活TGF-β/Smad3途徑促進膠原前合成的活性肽。

目前的研究中，CP通過MAPK/AP-1信號通路抑制MMP的合成，進而抑制膠原蛋白的降解，同時激活TGF-β/Smad信號通路，促進膠原蛋白的合成[6]。但是，CP的功能肽段、結合受體、代謝途徑尚未完全闡明。膠原蛋白水解產物成分復雜，分子質量分布較廣，為了分析CP具體的功能肽段，對膠原蛋白水解產物進行檢測具有必要性。CP分子質量檢測方法有凝膠電泳法、尺寸排除色譜法、高效液相色譜與電噴霧-質譜聯用、液相色譜-質譜聯用、基質輔助激光解析電離飛行時間質譜，其中基質輔助激光解析電離飛行時間質譜具有快速、靈敏度高，分析質量范圍大的優點，被認為檢測膠原蛋白水解物分子質量的最佳方法[12]。

4.3 口服與外用相結合

口服CP與局部涂抹應用CP相結合正成為CP研究的新趨勢口服和外用CP的作用部位、機理不同[58]。局部應用CP的患者，表皮深層水合作用改善?？诜﨏P的患者皮膚的彈性得到改善，毛孔減少。局部應用CP與口服CP在皮膚抗老化中起協同作用，二者的作用是互補的而不是等效的，因此，將局部應用CP與口服CP兩種攝入方式結合起來具有重要意義。

5 討論

文章從CP局部涂抹應用的抗氧化作用、抗糖化作用、抗炎作用綜述了局部涂抹CP可能通過抑制氧化應激、降低AGEs、調節皮膚炎癥微環境來修復皮膚的內源性和外源性老化。并將口服CP的相關作用與局部涂抹應用CP進行比較?？诜头肿恿緾P可以作為一種保健功能食品成分來改善人體皮膚的水合作用、彈性和皺紋。局部涂抹應用和口服CP在遞送機制和修復機制上有所不同。改進CP的遞送載體，提高遞送效率有助于更好的發揮CP抗老化的作用。盡管攝入CP有許多好處，但是仍然缺乏大規模的臨床研究來證實，現有的證據仍是有限的、不標準的。CP未來在醫用耗材、保健食品、化妝品行業有著令人期待的前景。