基因治療用于乳腺癌的研究現狀

何祥宇 金榮仲

【摘要】 乳腺癌（breast cancer，BC）是女性最為常見的惡性腫瘤，也是全球女性癌癥死亡的主要原因。手術、放療和化療等常規治療的效果往往不如預期。基因治療通過糾正缺陷基因和調節基因的表達來達到預期的治療效果，目前已成為一種有前景的乳腺癌治療策略。在乳腺癌的基因治療中通常使用病毒載體和非病毒載體作為遞送載體。病毒載體具有較高的轉基因效率，但病毒載體存在免疫原性較高、具有插入突變的風險和生物安全性等問題。非病毒載體與病毒載體相比，細胞毒性、免疫原性和誘變性均較低。但它還需要解決基因轉移效率較低、特異性不足、基因表達持續時間短等問題。本文綜述了目前利用病毒載體和非病毒載體治療乳腺癌的研究現狀，這些基因治療載體各有優缺點，因此本文對目前使用的基因治療載體進行相關概述。

【關鍵詞】 乳腺癌 基因治療 病毒載體 非病毒載體

Current Status of Gene Therapy for Breast Cancer/HE Xiangyu， JIN Rongzhong. //Medical Innovation of China， 2023， 20（11）： -183

[Abstract] Breast cancer （BC） is the most common malignant tumor in women and the leading cause of cancer death in women worldwide. Conventional treatments like surgery， radiation and chemotherapy often don't work as well as expected. Gene therapy has become a promising strategy for breast cancer treatment by correcting defective genes and regulating gene expression to achieve the desired therapeutic effect. Viral and non-viral vectors are commonly used as delivery vectors in gene therapy of breast cancer. Viral vectors have high transgene efficiency， but there are some problems such as high immunogenicity， insertional mutation risk and biosafety of viral vectors. Non-viral vectors showed lower cytotoxicity， immunogenicity and mutagenicity than viral vectors. But it also needs to solve the low efficiency of gene transfer， lack of specificity， short duration of gene expression and other problems. This article reviews the current research status of the use of viral vectors and non-viral vectors in the treatment of breast cancer. These gene therapy vectors have their own advantages and disadvantages， so this article summarizes the current use of gene therapy vectors.

[Key words] Breast cancer Gene therapy Viral vectors Non-viral vectors

First-author's address： College of Intelligent Medicine and Biotechnology， Guilin Medical University， Guilin 541199， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.11.042

乳腺癌是絕經后婦女的主要死亡原因之一，占所有因癌癥而死亡女性人數的23%[1]。目前乳腺癌的主要常規治療方法包括手術治療、化療、放射治療、激素治療、免疫治療。但是有多達1/3的乳腺腫瘤，對標準常規治療會產生耐藥或轉移。所以引入基因治療可以降低乳腺癌患者的死亡率，并提高患者的生活質量[2]。同時基因治療還可以提高現有標準治療的效果。

基因治療指的是將遺傳物質（DNA或RNA）轉移到患者的細胞中，改變患者的基因以達到治療、治愈或預防某種疾病或改善其健康狀況的治療[3]。轉移的遺傳物質通常通過以下三種方式之一來發揮作用：（1）外源基因能夠表達并發揮功能。（2）抑制細胞自身靶基因的表達和功能。（3）修飾靶基因，改變細胞原有基因的功能。一般情況下，基因治療需要載體將特定遺傳物質遞送到靶細胞中。基因載體可以是病毒載體或非病毒載體，他們在宿主體內保持活躍的時間，主要是取決于它們與宿主免疫系統等的相互作用和穿透所有屏障的能力，因此它們具有不同的免疫原性、表達水平和生物安全性。在基因治療中這些基因載體是起到安全有效治療的重要因素，因此需要慎重選擇[4]。

1 病毒載體的基因治療

病毒載體是將遺傳物質有效遞送到細胞中的工具。它們利用病毒的天然能力將有效遺傳物質傳遞到細胞中，使腫瘤的復制能力受損或喪失。病毒載體具有較高的轉基因效率，因此它們經常用于各類癌癥的基因治療中[5]。成功的病毒載體基因治療的效果可以持續很多年，這樣既可以減輕患者的疾病負擔，又能大大提高患者的生存質量。盡管使用病毒載體的研究已經顯示出相對有益的結果，但病毒載體的使用往往受到固有缺點的限制，包括免疫原性、插入突變、載量小和無法到達實體瘤。在此對已被用于基因治療的五種病毒載體進行概述。

1.1 腺病毒載體 腺病毒載體（Ads）具有許多優點，因此是基因治療中最常用的病毒載體之一。Ads是無包膜的并且具有雙鏈DNA基因組的二十面體蛋白質衣殼（直徑≥90 nm）。Ads的基因組DNA范圍為26～45 kb，側翼為兩個反向末端重復序列（ITR）。腺病毒基因組在宿主細胞核中保持游離狀態。Ads具有大包裝尺寸，高達30 kb。Ads基因組作為附加體維持在細胞核中，因此使病毒基因組DNA整合到宿主基因組中的概率能夠最小化，這降低了外源基因插入人類基因組進而誘發結構變異的風險。此外，Ads可以有效轉導廣泛的靶細胞，包括分裂的細胞和靜止的細胞。

根據腺病毒載體在靶細胞中的復制能力，重組腺病毒載體可分為復制型和非復制型[6]。研究發現，通過瘤內注射編碼白細胞介素-12（IL-12）的非復制型Ads與表達抗血管生成肽激素血管緊張素的Ads聯合使用，可在乳腺癌小鼠模型中產生協同抗腫瘤作用[7]。有研究發現，Survivin是細胞凋亡抑制蛋白（IAP）家族的一員。Survivin的表達已被證明與癌癥耐藥性有關。紫杉醇是目前治療乳腺癌最常用的化療藥物之一。然而，紫杉醇的獲得性耐藥是其最終化療失敗的重要原因之一。紫杉醇耐藥的機制之一是凋亡調控蛋白Survivin的改變。研究人員使用攜帶針對Survivin的小干擾RNA（siRNA）的重組腺病毒載體來治療乳腺癌，結果顯示了特異性siRNA對Survivin的抑制，增強了紫杉醇誘導的乳腺癌細胞的凋亡[8]。Ads介導的基因治療主要問題是該載體具有很強的免疫原性和全身給藥的假定毒性，所以瘤內給藥似乎是解決該問題的一個好方法。

1.2 單純皰疹病毒載體 單純皰疹病毒（HSV）是α-皰疹病毒亞家族的成員，該病毒含有120 kb的雙鏈DNA基因組，編碼70個或更多的基因。目前，lysotype HSV是第一個被開發成重組溶瘤病毒治療載體的病毒，也是第一個對抗癌癥的溶瘤病毒。HSV具有以下優點：（1）HSV在細胞中能夠快速復制并具有感染多種癌細胞的能力。（2）HSV的基因組較大，可以修飾并插入多個額外的轉基因[9]。（3）當劑量開始對患者的生命構成威脅時，可以使用抗病毒藥物應對其產生的副作用[10]。（4）修飾HSV的糖蛋白可以改善對腫瘤細胞的靶向性[11]。

溶瘤單純皰疹病毒（oHSV）載體已經被證明是一種安全有效的治療乳腺癌的基因治療載體[12]。oHSV病毒載體在腫瘤內通過選擇性復制和病毒誘導，使細胞裂解并直接破壞腫瘤細胞。G47Δ是基于G207的第三代可復制HSV-1載體。該研究發現G47Δ可以有效殺死不同亞型的乳腺腫瘤細胞。G47Δ對人乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-435和MDA-MB-468具有高度殺傷性，第4天時，超過98%的腫瘤細胞已經死亡，MOI為0.01。該研究還證明，G47Δ可以有效地靶向來自不同乳腺癌亞型的非癌干細胞（non-cancer stem cells，NCSCs）和癌癥干細胞（cancer stem cells，CSCs），G47Δ還會損害CSCs的自我更新能力。G47Δ也表現出與紫杉醇的協同作用，可在體外和體內放大對NCSCs和CSCs的殺傷力[13]。

1.3 腺相關病毒載體 腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）也稱為腺伴隨病毒，屬于微小病毒科依賴病毒屬，是目前發現的一類結構最簡單的單鏈DNA缺陷型病毒，復制時需要輔助病毒的參與。AAV于1965年被首次分離，雖然它不能自主復制，但AAV能夠感染多種宿主細胞，包括分裂和不分裂細胞。感染后AAV基因組在宿主細胞中保持潛伏，在腺相關病毒整合位點（AAVS1）整合到宿主細胞的DNA中。AAV復制和感染需要輔助病毒，如Ads或HSV共感染。盡管AAV感染在人類中很常見，但目前沒有證據證明該病毒可以直接引起特定的疾病。AAV在人體中是非致病性的，并且由于能夠轉導多種類型的細胞，因此AAV是基因治療遞送遺傳內容的理想候選載體之一。AAV是很有潛力的治療性基因傳遞載體，因為它能夠轉導廣泛的組織，并以較低的免疫原性長期表達。這些優點和較好的安全性使它成為抗腫瘤基因治療的理想載體之一。

已有研究表明，野生型AAV-2型的感染可誘導不同的乳腺癌細胞系進行凋亡，通過瘤內注射AAV-2到人MDA-MB-435乳腺腫瘤裸鼠移植瘤中可延緩腫瘤的生長并誘導腫瘤細胞壞死[14]。CH50是一種人纖連蛋白的重組CBD-HepⅡ多肽。研究發現用編碼CH50的重組AAV-2載體來感染人乳腺癌細胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468并分泌可溶性的CH50。在兩種乳腺癌細胞中，CH50通過干擾乳腺癌模型中的aVb3的信號傳導來發揮其抗轉移的作用。CH50對aVb3表達的下調抑制了乳腺癌細胞與ECM蛋白的黏附，進而抑制了FAK的激活、cdc2的上調及MMP-9的產生和激活。結果表明，重組腺相關病毒（rAAV）載體介導的CH50可以持續表達并抑制原位乳腺癌異種移植物的生長和自發轉移。也就是說rAAV-CH50介導的基因轉移可以抑制乳腺癌的早期腫瘤轉移[15]。同時AAV也存在一些缺點，比如它的包裝容量僅在5 kb以下，而且在某些細胞中的轉導效率和特異性偏低。

1.4 逆轉錄病毒載體 逆轉錄病毒是基因轉移的有效工具。它能夠將遺傳信息穩定地整合到宿主細胞染色體中。這種插入是通過逆轉錄將RNA基因組轉化為雙鏈的DNA[16]。在感染的細胞有絲分裂后，雙鏈DNA可以整合到宿主基因組中并產生表達[17]。逆轉錄病毒分為兩種：簡單的逆轉錄病毒，如Moloney鼠白血病病毒和復雜的慢病毒（LVs），如人類免疫缺陷病毒（HIV）。簡單的逆轉錄病毒只能感染活躍的分裂細胞，而LVs能感染分裂的細胞，也能感染未分裂的細胞[18]。這些載體能夠進入到哺乳動物細胞并且長期穩定表達，使得它們成為基因治療的理想候選載體。

慢病毒（LVs）已被用于轉導外周血T細胞表達嵌合抗原受體（CAR）。該受體由腫瘤抗原特異性抗體與T細胞內信號域融合而成。然后將CAR-LVs轉導的T細胞重新注射到宿主體內，以特異性靶向表達抗原的乳腺腫瘤細胞，如HER-2和MUC-1[19]，或FRα[20]。在一項研究中，皮下注射編碼乳腺腫瘤抗原HER-2胞外區的LVs疫苗，可使攜帶自發性乳腺腫瘤的BALB/c-HER-2/Neu轉基因小鼠產生抗腫瘤免疫[21]。LVs的多功能使其成為治療轉移性乳腺癌的免疫基因治療的理想候選載體。雖然它的生產復雜并且滴度不高，但是因為它的低免疫原性和長期轉基因表達等優點，使LVs成為癌癥治療的首選病毒載體之一。

1.5 新城疫病毒 新城疫病毒（NDV）是20世紀后期以來發現的首批溶瘤病毒之一[22]。NDV通過半胱天冬酶依賴性和半胱天冬酶非依賴性途徑誘導細胞凋亡[23]。NDV又稱禽副粘病毒1型（APMV-1），屬于副粘病毒科的Avulavirus屬。它是一種有包膜的單鏈RNA病毒，基因大小為16 kb。在腫瘤細胞中具有溶瘤活性，而在正常的人類細胞中不具有溶瘤活性。NDV作為抗癌劑的一些優點包括：（1）通過受體介導的內吞作用進入細胞，能夠與細胞進行良好的結合。（2）在腫瘤細胞中進行選擇性復制而且不依賴細胞的增殖。（3）沒有嚴重的毒副作用[24]。

癌細胞通常需要大量的葡萄糖產生能量來支持它的代謝功能[25]。乳腺癌的干細胞具有發酵糖酵解依賴性，這使得它對糖酵解抑制劑較為敏感[26]。D-甘露庚酮糖（MH）是一種不可代謝的葡萄糖類似物，可以抑制己糖激酶，從而阻止癌細胞產生能量達到抗癌的作用[27]。研究結果表明，MH和NDV的組合可以通過抑制糖酵解途徑和誘導細胞凋亡對乳腺癌細胞系產生有效的細胞毒作用，但對正常REF細胞系沒有細胞毒作用[27]。新城疫病毒AF2240是一種速生毒株。經研究證明，新城疫病毒AF2240在體外以時間依賴的方式誘導MDA-MB-231細胞凋亡，而對內皮HUVEC細胞和Hs578Bst乳腺上皮細胞等正常細胞沒有毒性[28]。然而，仍有待確定的是NDV可以表達多少轉基因及它可耐受的最大基因組的大小。

2 非病毒載體的基因治療

非病毒性載體與病毒載體相比，非病毒載體的細胞毒性、免疫原性和誘變性均較低，這些優點吸引了很多研究人員對其進行進一步的探索，從而推動了基因治療領域的快速發展。但是非病毒載體用于基因治療目前還存在較多的問題，它需要解決基因轉移效率、特異性、基因表達持續時間和安全性等關鍵問題。非病毒載體需要保護遺傳物質免受核酸內切酶的降解，并向細胞核進行轉運和核攝取。而載體和細胞之間往往因治療方式不同而產生不同的相互作用，這樣會對轉染的效率產生較大的影響。除效率之外，其毒性也不容忽視，免疫毒性則主要取決于具體的細胞和載體材料。但大多數非病毒基因載體的免疫毒性低于病毒載體，因此需要根據具體的情況對其進行評估。以下是用作基因治療的三種非病毒載體類型。

2.1 聚酰胺胺（PAMAM）樹枝狀大分子 PAMAM樹枝狀大分子常用于藥物和基因的遞送。PAMAM樹枝狀大分子表面的正電荷降低了它的細胞毒性。PAMAM的特點如：高效的遞送、特異靶向性、生物降解性、無毒性、非免疫原性和保護DNA免受降解的能力。PAMAM樹枝狀大分子為基因遞送提供了一種有前景的載體[29]。與病毒輸送載體相比，非病毒載體因其許多的優點而備受推崇[30]。但因其細胞的轉染率較低，限制了它在臨床上的應用。

Polo樣激酶1是由Plk1基因編碼的絲氨酸/蘇氨酸激酶[31]。Plk1基因的活性在增殖的癌細胞中升高[32]。用抗Plk1 siRNA（siPlk1）抑制Plk1會導致有絲分裂停滯、細胞凋亡和抑制腫瘤生長[33]。然而siRNA的傳遞較困難，因為它們是帶高負電荷的分子，因此它們不能輕易地穿過細胞膜。該研究使用應用于癌癥治療的PAMAM樹枝狀大分子的第4代（PG4）作為基因治療載體。PG4與抗癌siRNA（siPlk1）復合形成siPlk1-PG4 dendriplex。PG4可以有效保護siPlk1免受核糖核酸酶（RNase）的影響，同時增強了siPlk1的血清穩定性。通過進行MCF-7細胞的體外抗癌活性研究表明，siPlk1-PG4可以導致細胞死亡。與裸siPlk1溶液相比，siPlk1-PG4導致MDA-MB-231細胞對siPlk1的攝取增強。通過細胞周期分析，與裸siPlk1溶液相比，siPlk1-PG4增加了亞G1期的細胞群停滯。結果表明，PG4可能是乳腺癌治療中遞送siPlk1的潛在載體[33]。

2.2 二硫交聯聚乙烯亞胺（PEI-SS） PEI-SS是使用低分子量聚乙二醇（PEI）和二硫鍵為交聯劑合成的。PEI-SS是一種谷胱甘肽反應性基因載體[34]，PEI-SS作為一種聚陽離子可以與miRNA結合生成PEI-SS/miRNA多聚體[35]。

微小核糖核酸MicroRNA（miRNA）是一種小的非編碼RNA分子，約含有22個核苷酸。miRNA在基因表達的轉錄和轉錄后調控中起到關鍵的作用[36]。基因載體則幫助miRNA穿過細胞膜，并保護miRNA免受體核酸內切酶的降解[37]。目前，PEI-SS已被認為是傳遞DNA/miRNA的高效基因載體。

在一項研究中，PEI-SS首次被描述作為miRNA的非病毒載體。通過MTT測定PEI-SS對MDA-MB-231（人乳腺癌細胞系）的細胞毒性，顯示PEI-SS具有較低的細胞毒性。PEI-SS能有效結合anti-miR-155，形成10～100 nm的納米球形結構復合物。這種復合體被癌細胞中的還原劑谷胱甘肽（GSH）降解，然后釋放出anti-miR-155并有效抑制腫瘤的生長。為了測試PEI-SS/anti-miR-155復合物的體內治療效果，將3×105個MDA-MB-231細胞注射到裸鼠的乳腺脂肪墊中構建了異種移植腫瘤小鼠模型。在腫瘤生長期，發現與陰性對照相比，PEI-SS/anti-miR-155顯著抑制了腫瘤的生長[34]。

2.3 無機納米粒子（NPs） 研究人員發現，可以用NPs作為基因載體，因為它們顯示出了優于傳統有機載體的幾個優點，分別是它們的尺寸較小，穩定性較高及易于合成[38]。金納米顆粒（AuNPs）作為無機納米粒子中的一種表現出了許多有利的特性，這有助于將其作為基因傳遞的載體[39]。siRNA能以靜電結合的方式到陽離子聚合物包覆的AuNPs上，而且AuNPs的一個主要優勢是它們的合成是可調的，允許合成不同的尺寸和形狀。聚乙烯亞胺（PEI）修飾的AuNPs有助于在體外和體內的三陰型乳腺癌（TNBC）模型中有效地敲除真核細胞延伸因子激酶（EEF-2K）基因[40]。有報道用天然聚合物殼聚糖（CS）包裹的AuNPs成功地將c-myc siRNA導入MCF-7細胞。這些納米復合體促進了MCF-7細胞中c-myc癌基因的顯著下調[41]。Ahwazi等[42]使用包被HIV-1 TAT的AuNPs在MDA-MB-231細胞中敲除掉了ROR1基因。

介孔二氧化硅納米粒子（MSNPs）也是一種無機納米粒子，它含有直徑為2～50 nm的孔，因其具有生物相容性、大孔徑和高負載等能力，所以也是理想的候選載體[43-44]。PEI包被的介孔二氧化硅顆粒（MSNs）已被用于在體外和體內的MDA-MB-231模型中敲低PKM2基因，從而降低蛋白質的表達并抑制細胞的遷移[45]。研究人員還通過在中孔內利用MSNPs的多孔結構加載siRNA，從而防止核酸酶的降解。據報道，在MDA-MB-231模型中，使用具有23 nm大孔徑的MSNPs封裝siRNA，可以使血管內皮生長因子（VEGF）基因在體外和體內得到了顯著的下調[46]。

3 總結與展望

在過去的幾十年中，基因治療得到了迅速的發展。如今通過基因療法治療癌細胞，然后應用抗腫瘤的化學藥物或放射療法治療可以達到腫瘤消退的效果。在乳腺癌的基因治療中使用病毒載體和非病毒載體作為遞送載體已經引起了人們的關注，并發揮出了一定的療效。在基因治療中，載體的作用十分關鍵，用于基因遞送的最佳載體應表現出高效的負載能力，具有對特定靶細胞的趨向性，高效的轉導性和較少的細胞毒性。在這篇綜述中，討論了病毒載體和非病毒載體的研究現狀，其中病毒載體包括：腺病毒、HSV、腺相關病毒、逆轉錄病毒和NDV。非病毒載體包括：PAMAM樹枝狀大分子、PEI-SS和NPs。利用病毒載體或非病毒載體運送核酸作為治療途徑似乎是治療乳腺癌的一種好策略。但是自從基因治療問世以來，它的安全性和有效性一直是人們擔心的問題。通常，人們認為病毒載體的效果更佳，但非病毒載體在大規模生產的簡易性和較低的免疫原性等方面更具優勢，繼而開發出更加安全和高效的載體是非常必要的。將病毒載體與非病毒載體相結合，似乎是一種具有良好發展前景的基因治療載體新技術，并且這種組合將利用兩種方法的優勢來繞過目前存在的障礙。

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（收稿日期：2022-10-21） （本文編輯：何玉勤）