TaqMan-MGB 多重?zé)晒舛縋CR檢測PCV2、Hps 和Mhp 方法的建立和應(yīng)用

遲玉華，金風(fēng)英，韓 勇

1.山東省日照市東港區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，山東日照 276800；2.山東省日照市畜牧開發(fā)服務(wù)站，山東日照 276800；3.山東省日照市動物疫病預(yù)防控制中心，山東日照 276800

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）是圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬的一種無囊膜環(huán)狀單鏈DNA 病毒，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的具有自主復(fù)制能力的最小的動物病毒[1]。目前，豬圓環(huán)病毒有PCV1、PCV2、PCV3、PCV4 4 種，臨床上對生產(chǎn)危害嚴(yán)重的主要是PCV2。PCV2 能引起免疫抑制，繼發(fā)感染嚴(yán)重，導(dǎo)致病情復(fù)雜。田瑤等[2]對98 份疑似PCV 的病料進(jìn)行熒光PCR 檢測，PCV2 陽性率達(dá)65.3%。副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）可引起仔豬呼吸困難、多發(fā)性纖維素性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎。豬支原體肺炎又稱豬喘氣病，是由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起，臨床上主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽和呼吸困難。

臨床上，豬群感染PCV2 后容易引起免疫抑制，導(dǎo)致豬體抵抗力下降，繼發(fā)Hps 和Mhp，致使癥狀難以鑒別診斷，給防控工作帶來較大的難度。因此，亟需開發(fā)一種快速、特異、有效的方法對豬群進(jìn)行監(jiān)測，防控疫病。本研究采用當(dāng)前先進(jìn)的TaqMan-MGB探針技術(shù)，建立TaqMan-MGB 多重?zé)晒舛縋CR，在一個反應(yīng)體系中1 次檢測PCV2、Hps 和Mhp，建立快速準(zhǔn)確的鑒別診斷方法，為防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 病料樣品和病毒株

病料來自2019—2020 年日照市屠宰場、無害化處理廠和部分養(yǎng)豬場（戶）。豬圓環(huán)病毒1 型（PCV1）、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）、豬圓環(huán)病毒3 型（PCV3）、豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus，PPV）、Hps、豬放線桿菌（APP）、大腸桿菌（E.coli，O78 株）均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。豬圓環(huán)病毒4 型（PCV4）由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院提供，豬偽狂犬活疫苗(PRV，Bartha 株)購自梅里亞公司，豬乙型腦炎活疫苗(JEV，SA14-14-2 株）購自武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司，豬瘟活苗(CSFV)購自青島易邦生物有限公司，豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(PRRSV，JXA1-R 株)購自齊魯動物保健品有限公司，豬支原體肺炎活疫苗（Mhp，RM48 株）購自齊魯動物保健品有限公司，豬鏈球菌（SS2，ST-171 株）購自山東綠都生物有限公司，豬多殺性巴氏桿菌活疫苗（Pasteurella，679-230 株）購自福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

西安天隆DNA/RNA 核酸提取試劑盒購自西安天隆科技有限公司；PCR 反應(yīng)液（TSE301 2xT5 Fast qPCR Mix）購自北京擎科生物有限公司；NP968 自動核酸提取儀購自西安天隆科技有限公司；MM400自動破碎儀購自德國萊馳公司；ABI7500 熒光定量PCR 儀購自ABI 公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)和合成

在Genbank 上選取PCV2-ORF2、Hps-tbpA、Mhp-p36基因，利用DNAMAN8 比對，找出序列保守區(qū)。利用Primer express 3.0 軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)引物及探針，引物和探針均由北京擎科生物有限公司合成（表1）。

表1 引物與探針序列

1.4 核酸的提取

核酸提取采用西安天隆DNA/RNA 提取試劑盒，由西安天隆提取儀提取核酸，提取后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

人工合成目的基因，兩端均連到質(zhì)粒pClone 007，合成重組質(zhì)粒，分別命名為重組質(zhì)粒PCV2-ORF2、Hps-tbpA、Mhp-p36，測序結(jié)果正確。以上均由北京擎科生物有限公司完成。

1.6 反應(yīng)體系優(yōu)化

在獲得最優(yōu)單一PCR 反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，多重PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化是該檢測方法建立的關(guān)鍵所在[3]。本研究以質(zhì)粒PCV2-ORF2、Hps-tbpA、Mhpp36 為檢測模板，對反應(yīng)條件進(jìn)行摸索和優(yōu)化，以達(dá)到最優(yōu)組合。

1.7 特異性試驗(yàn)

利用所建立的熒光定量PCR 方法對PCV1、PCV2、PCV3、PCV4、PRV、PPV、Hps、MPS、APP、SS2、E.coli、JEV、CSFV、PRRSV 核酸進(jìn)行檢測，同時設(shè)陰性對照，評價方法的特異性。

1.8 敏感性試驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線

用紫外分光光度計(jì)在260 nm 測定質(zhì)粒的吸光度，計(jì)算質(zhì)粒的濃度。將已制備的質(zhì)粒PCV2-ORF2、Hps-tbpA、Mhp-p36 作10 倍稀釋，以重組質(zhì)粒終濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以復(fù)孔的平均CT 值為縱坐標(biāo)，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

質(zhì)粒進(jìn)行10 倍梯度稀釋，用建立的方法進(jìn)行檢測，每個濃度梯度重復(fù)3 次進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，再分別選取3 個不同時間對3 個濃度梯度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行組間重復(fù)試驗(yàn)。

1.10 臨床樣品的檢測

臨床采集144 份豬樣品進(jìn)行檢測。病豬采集淋巴結(jié)等組織處理，核酸提取使用西安天隆DNA/RNA 核酸提取試劑提取。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)體系

確定PCV2-ORF2-F（10 μmol/L）0.5 μL；PCV2-ORF2-R（10 μmol/L）0.5 μL；Hps-tbpA-F（10 μmol/L）0.5 μL；Hps-tbpA-R（10 μmol/L）0.5 μL；Mhp-p36-F（10 μmol/L）0.5 μL；Mhpp36-R（10 μmol/L）0.5 μL；PCV2-ORF2-PROBE（10 μmol/L）0.4 μL；Hps-tbpA-PROBE（10 μmol/L）0.4 μL；Mhp-p36-PROBE（10 μmol/L）0.4 μL；反應(yīng)液（2xT5 Fast qPCR Mix）12.5 μL；模板各2 μL；加無菌水到25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；95 ℃15 s，60 ℃30 s，40 個循環(huán)；60 ℃收集熒光（擴(kuò)增見圖1）。

圖1 重組質(zhì)粒PCV2-ORF2、Hps-tbpA、Mhp-p36 熒光PCR 多重?cái)U(kuò)增曲線

2.2 特異性試驗(yàn)

PCV1、PCV2、PCV3、PCV4、PRV、PPV、Hps、MPS、APP、SS2、E.coli、Salmonella、Pasteurella、JEV、CSFV、PRRSV 核酸的檢測結(jié)果顯示，只有PCV2、Hps、Mhp 出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其他病原核酸和陰性對照均無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，表明建立的方法具有良好的特異性。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和敏感性評價

質(zhì)粒PCV2-ORF2、Hps-tbpA、Mhp-p36 按10倍稀釋進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，結(jié)果顯示CT 值與熒光信號呈現(xiàn)的線性關(guān)系良好，擴(kuò)增效果較好。質(zhì)粒PCV2-ORF2、Hps-tbpA、Mhp-p36 最低檢出濃度分別為1.33×10、1.77×10、1.86×10 copies/μL，提示該方法具有較高的敏感性，結(jié)果見圖2-圖4。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2分別為0.999 1、0.999 4 和0.999 5，CT 值與拷貝數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖2 質(zhì)粒PCV2-ORF2 熒光PCR 敏感性試驗(yàn)

圖3 質(zhì)粒Hps-tbpA 熒光PCR 敏感性試驗(yàn)

圖4 Mhp-p36 熒光PCR 敏感性試驗(yàn)

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

以質(zhì)粒PCV2-ORF2、Hps-tbpA、Mhp-p36 為模板，分別進(jìn)行3 次批內(nèi)和批間重復(fù)檢測，結(jié)果顯示批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于2%，表明所建的熒光定量PCR 方法重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。

2.5 臨床樣品的檢測

用建立的熒光PCR 方法對144 份臨床樣品進(jìn)行檢測，分別檢出PCV2-ORF2、Hps-tbpA、Mhp-p36陽性樣品67、54、29 份。同時，用商品熒光PCR 試劑盒做比對，2 種檢測方法的符合率為100%。

3 討論

1）豬圓環(huán)病毒有2 個主要的開放閱讀框ORF1和ORF2，分別編碼病毒復(fù)制蛋白（Rep）和病毒衣殼蛋白（Cap）。Cap 是病毒主要的免疫原性蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白，位于基因組的負(fù)鏈，與病毒致病性密切相聯(lián)，被認(rèn)為最易變異的蛋白[4]。同源性比對表明，PCV1、PCV2 和PCV3 之間，ORF2 基因的差異性最高。對PCV2 與PCV3 的Cap 蛋白進(jìn)行氨基酸序列分析，同源性約為30%，預(yù)測PCV2 與PCV3 不能進(jìn)行交叉免疫保護(hù)[5]。PCV4 與PCV1、PCV2 和PCV3 氨基酸同源性分別為43.1%、45.0%、24.5%[6]。Cap 蛋白具有免疫原性，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，是診斷試劑與基因工程疫苗的主要基因靶點(diǎn)。

P36 蛋白是Mhp 種特異性蛋白，也稱之為乳酸脫氧酶，具有較高的種屬特異性[7]。經(jīng)證實(shí)P36 蛋白是一種免疫優(yōu)勢蛋白，在感染后期能產(chǎn)生較強(qiáng)的針對蛋白的抗體。Del 等[8]報(bào)道了Hps 中轉(zhuǎn)鐵蛋白鐵離子攝取系統(tǒng)是由tonB、exbD、tbpB、tbpA基因組成。這些均表明TbpA和TbpB在Hps 攝取鐵離子中的重要作用，進(jìn)而提示Tbp有可能為Hps 的毒力因子之一。

本試驗(yàn)選擇PCV2-ORF2、Hps-tbpA、Mhp-p36基因，找到各自保守序列，采用TaqMan-MGB 探針法，利用軟件primer 3.0 設(shè)計(jì)引物和探針，保證方法的特異性和敏感性。本方法建立的TaqMan-MGB 熒光定量PCR，穩(wěn)定性、敏感性強(qiáng)，可檢測質(zhì)粒PCV2-ORF2、Hps-tbpA、Mhp-p36 分別達(dá)到1.33×10、1.77×10、1.86×10 copies/μL。方法具有良好的特異性，與其他常見豬病原不發(fā)生交叉反應(yīng)。

2）為加快生豬種業(yè)資源高質(zhì)量發(fā)展，掌握PCV2、Hps、Mhp 流行狀況，應(yīng)用建立的方法對日照市2019—2021 年豬場點(diǎn)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示PCV2、Hps、Mhp 場點(diǎn)感染率超過25%，樣品陽性率超過10%，感染情況不容樂觀，需引起足夠重視，下一步要把PCV2、Hps、Mhp 作為重點(diǎn)防控疫病，加強(qiáng)監(jiān)測，從源頭上控制PCV2、Hps、Mhp 流行。