蠶絲-PLGA復(fù)合工程支架在大鼠肌腱損傷中的修復(fù)作用

梁永超,劉偉亮,王春龍,馮海蓮,王嬌

(1.秦皇島市第三醫(yī)院外三科;2.通用環(huán)球中鐵山橋醫(yī)院骨外科; 3.秦皇島市婦幼保健院手術(shù)室;4.通用環(huán)球中鐵山橋醫(yī)院手術(shù)室,河北 秦皇島 066000)

肌腱損傷是常見的運動性損傷,可導(dǎo)致患肢疼痛及功能障礙,對患者生活質(zhì)量有嚴(yán)重影響[1]。肌腱損傷后自我修復(fù)、愈合緩慢,損傷后的修復(fù)仍是臨床難題[2]。臨床常使用肌腱修復(fù)縫合術(shù)(完全斷裂)或石膏/夾板固定、理療、鎮(zhèn)痛消腫等非手術(shù)手段(部分斷裂)進行傳統(tǒng)治療,盡管有一定的臨床價值,但其療效仍未達理想,患者治療后肌腱功能難以恢復(fù)至受損前水平[3]。因此,關(guān)于肌腱缺損組織工程化研究一直是現(xiàn)今研究的重點、熱點。支架材料是主要限制組織工程研究結(jié)果應(yīng)用于臨床的因素之一[4],故而研制生物力學(xué)性能、生物相容性更好的新型支架材料具有重要價值。

聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid,PLGA)的生物相容性、可降解性俱佳,是常用的高分子材料[5]。當(dāng)前領(lǐng)域中將蠶絲和PLAG材料復(fù)合制備組織工程支架已有報道,其生物相容性已被證實[6-7],但將其應(yīng)用于肌腱修復(fù)方面尚無報道。本研究擬探討蠶絲-PLGA復(fù)合材料制備的工程支架對肌腱損傷中的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級雄性SD大鼠48只(北京維通利華),6～8周齡,體重200～220 g。均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,通風(fēng)良好,溫度:25 ℃,相對濕度:50%,不限制飲食、飲水。本實驗已通過倫理審批(編號:20200801)。

1.2 材料與試劑

蠶絲由河北秦皇島蠶農(nóng)贈送,PLGA細絲(GA∶LA=90∶10,上海天清),單絲直徑17 μm,每束含12根單絲,色乳白,質(zhì)柔軟。LG-DMEM(Gibco),胎牛血清(FBS,杭州四季青),胰蛋白酶(Sigma),24、96孔塑料培養(yǎng)板為Costar產(chǎn)品。

1.3 蠶絲-PLGA支架的制備

500 mL Na2CO3溶液(0.3%)中添加1 g蠶絲,煮沸兩次,30min/次,去除絲膠,獲取蠶絲絲素纖維,清洗、晾干、備用。制作蠶絲-PLGA支架,編織次序為:取蠶絲絲素纖維單絲(160根)、PLGA細絲單絲(96根)混合均勻(質(zhì)量比為2∶3),平行排列(記為×1),將其按順時針(記為×2)-逆時針(記為×4)-順時針(記為×8)-逆時針(記為×16)-順時針(記為×32)-逆時針(記為×48)的次序進行扭合,每次均由2捻扭合成1小索,即完成蠶絲-PLGA混合編織支架(包含兩種單絲共12 288根)。75%乙醇消毒30 min后,充分清洗、晾干。術(shù)前,將蠶絲-PLGA支架剪成5 mm×2 mm×1 mm,采用無菌PBS溶液浸泡過夜。

1.4 大鼠肌腱損傷模型的建立、分組及處理

將48只雄性SD大鼠按隨機數(shù)字表法分成實驗組和對照組,每組各24只。實驗組與對照組參照文獻[8]方法造模,予以水合氯酸溶液(0.3～0.5 mL/100 g)腹腔注射麻醉,麻醉后,將大鼠擺放呈俯臥位,固定四肢,備皮,先用碘伏消毒,然后酒精脫碘。于后肢外側(cè)作切口,分離周圍的組織,暴露跟腱,盡量避免對營養(yǎng)血管造成損傷,小心分離排腸肌內(nèi)側(cè)頭肌腱。實驗組在跟腱離斷后,將蠶絲-PLGA支架植入大鼠肌肉,與腱組織緊密貼合,然后縫合皮膚。對照組在跟腱離斷后,僅進行皮膚切口的縫合,不作任何修復(fù)。

1.5 取材

分別于術(shù)后1、2、3、4周進行取材,每次每組取6只大鼠。解剖以顯露術(shù)區(qū),進行大體觀察。并對肌腱損傷組織進行解剖,對損傷處的愈合情況以及生物膜吸收情況進行觀察。采集損傷的肌腱組織,用無菌PBS進行清洗后,以4%多聚甲醛予以固定處理,置于-4 ℃下保存,用于后續(xù)測定。

1.6 HE染色組織學(xué)評價

待測組織用4%多聚甲醛固定,依次完成脫水、透明、浸潤、包埋操作,切片(4～10 μm),HE染色,利用電鏡下觀察樣本中膠原纖維成熟等情況。

1.7 免疫組化檢測膠原蛋白III的表達

待測組織用4%多聚甲醛固定,乙醇梯度脫水、清洗,予以石蠟包埋,切片(5μm),HE染色,使用免疫組化法檢測樣本膠原蛋白III表達水平。

1.8 生物力學(xué)測試

取各組組織標(biāo)本,通過單軸拉伸測試其最大拉伸應(yīng)力。新鮮取材的組織先測其橫截面積,將材料修剪成長條型,兩端夾具固定,沿長軸方向均勻的對樣品進行力學(xué)加載,拉伸速度為5 mm/min,記錄最大拉力載荷。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

造模后1 d,實驗組與對照組即恢復(fù)自主進食,能夠正常走動跳躍,行為未受影響,但均存在不同程度攝食減少;所有大鼠術(shù)后均未見紅腫感染。

術(shù)后1周,實驗組采用血管鉗進行切口鉗鈍性分離、顯露深層組織,可見皮膚、周圍存在水腫,肌腱修復(fù)區(qū)愈合不牢,予以輕微牽拉便可見組織分離,能夠清晰辨認生物支架,與肌腱組織易分離;對照組同樣存在周圍組織水腫。術(shù)后2周,實驗組切口愈合良好,通過銳性切開顯露術(shù)區(qū),組織水腫減輕,生物支架與肌腱貼合緊密;對照組的肌腱損傷處和周圍組織輕微黏連,但可經(jīng)輕微鈍性分離。術(shù)后3周,實驗組切口基本愈合,生物支架與肌腱貼合致密,無法完整分離,且生物支架可見液化降解跡象,肌腱活動良好;對照組肌腱損傷處和周圍組織之間存在明顯粘連帶。術(shù)后4周,實驗組生物支架降解吸收,肌腱損傷處和周圍組織基本融合,肌腱活動正常;對照組損傷的肌腱損傷處和周圍組織明顯粘連,肌腱活動比較差。

2.2 組織學(xué)評價

術(shù)后1周,實驗組與對照組肌腱周圍組織均存在大量淋巴細胞,同時可見少量中性粒細胞,無巨噬細胞,伴隨少量成纖維細胞。術(shù)后3周、4周,實驗組術(shù)區(qū)支架外可見成纖維細胞大量聚集,可見膠原纖維排列緊密、規(guī)則,瘢痕組織形成,肌腱細胞生長入支架內(nèi);對照組肌腱損傷處成纖維細胞大量聚集,浸潤至正常細胞,膠原纖維排列松散、不整齊。見圖1。

2.3 兩組膠原蛋白III表達比較

與對照組比較,實驗組術(shù)后2、3、4周后膠原蛋白III表達水平均增高(P<0.05)。見表1。

表1 3組膠原蛋白III表達水平比較

2.4 兩組生物力學(xué)評價比較

與對照組比較,實驗組術(shù)后2、3、4周的肌腱最大拉力載荷均增大(P<0.05)。見表2。

表2 3組肌腱最大拉力載荷比較

3 討論

近年來,隨著組織工程醫(yī)學(xué)的持續(xù)發(fā)展,利用組織工程技術(shù)將有生命的種植體植入到損傷區(qū)域以加快肌腱損傷修復(fù),正成為當(dāng)前肌腱損修復(fù)研究領(lǐng)域的新思路[9-10]。但目前組織工程的實際應(yīng)用仍存在較大挑戰(zhàn),支架材料是主要限制因素之一,尋找適宜的支架材料是當(dāng)前階段的重點。PLGA是一種降解速度可控,機械性能及柔韌性均優(yōu)異的組織工程肌腱支架[11]。蠶絲的機械性能則因含有支鏈含有生長因子、黏附因子而獨具優(yōu)勢,在醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。既往研究[12]發(fā)現(xiàn),蠶絲可明顯吸附肌腱細胞,且生物相容性、力學(xué)性能均顯示良好,具有促進肌腱損傷修復(fù)、改善修復(fù)效果的巨大潛能。復(fù)合材料可有效結(jié)合天然材料、人工合成材料的優(yōu)勢,打破其局限性,從而改進材料性能。Sahoo等[13]發(fā)現(xiàn)細胞適應(yīng)材料伸展,呈梭形,并與支架材料呈大致平行的排列方式。當(dāng)前領(lǐng)域中將蠶絲和PLAG材料復(fù)合制備組織工程支架已有報道,其細胞毒性、生物相容性亦被實驗一一證實,但將其在肌腱修復(fù)應(yīng)用方面尚無論據(jù)。本研究構(gòu)建大鼠肌腱損傷模型,擬探討蠶絲-PLAG材料復(fù)合工程支架對肌腱損傷的修復(fù)作用。

在肌腱損傷修復(fù)中,設(shè)計生物膜或者管狀支架植入損傷部位,對于手術(shù)部位的固定有益,能夠提高抗拉強度,為術(shù)后早期活動創(chuàng)造穩(wěn)定修復(fù)環(huán)境,有利于新肌腱的生成[14-15]。本研究中,實驗組術(shù)后行為不受影響,能夠正常跳躍,說明該支架的應(yīng)用具有一定的可行性。肌腱有著與長軸平齊的具有層次感的纖維束結(jié)構(gòu),組織纖維排列整齊,呈正弦波型特征性結(jié)構(gòu)[16-17]。本研究組織學(xué)評價顯示,實驗組術(shù)后3、4周肌腱膠原纖維排列整齊且致密,且膠原蛋白III表達較高,而對照組肌腱膠原纖維排列無規(guī)則,且比較松散,提示蠶絲-PLGA復(fù)合工程支架能夠促進肌腱損傷的修復(fù),提高腱化效果。另外,本研究生物力學(xué)結(jié)果顯示,實驗組術(shù)后2、3、4周的肌腱最大拉力載荷均增大,充分證明蠶絲-PLGA復(fù)合工程支架能夠促進肌腱的愈合,增強其生物力學(xué)特性,是治療肌腱損傷的有效措施。

綜上,蠶絲-PLGA復(fù)合工程支架能夠促進肌腱損傷修復(fù),提高膠原蛋白III的表達,增強生物力學(xué)特性,是肌腱損傷的有效治療手段。