基于輔助生殖人群的染色體多態性回顧性研究*

趙冰清,高 選,劉 敏,陳 虹,李江夏

1.山東大學生殖醫學研究中心(山東大學附屬生殖醫院)/山東大學生殖內分泌教育部重點實驗室醫學檢驗科,山東濟南 250012;2.山東大學基礎醫學院醫學遺傳學系/實驗畸形學教育部重點實驗室,山東濟南 250012

輔助生殖技術(ART)是采用醫療輔助方法幫助不孕不育夫婦成功妊娠的技術,隨著ART的不斷發展和成熟,該技術在臨床上的應用越來越廣泛。不孕不育指的是夫妻同房一年以上未采取任何避孕措施,性生活正常但無法成功妊娠。目前約10%～15%的育齡夫婦存在不孕不育狀況[1]。導致不孕不育的原因復雜,主要包括遺傳、免疫、內分泌、生殖器官結構異常等因素。染色體多態性是遺傳因素之一,是指染色體異染色質區顯帶處理后帶紋寬窄或著色強度改變的微小差異,主要包括:(1)非近端著絲粒染色體長臂異染色質區的增減,主要是1、9、16號染色體次縊痕區長度;(2)近端著絲粒染色體(D/G組染色體)短臂上隨體和次縊痕區長度的變化;(3)9號染色體臂間倒位;(4)Y染色體多態性,包括Y染色體長臂異染色區長度的增減及臂間倒位。

本研究主要分析不孕不育夫婦的染色體多態性,比較不同染色體多態性的種類、發生率及其與患者激素水平、女性患者獲卵數[1]和男性患者精液情況的關系,從而探討染色體多態性對不孕不育夫婦的臨床影響,增強臨床對染色體多態性的重視,幫助臨床更好地為不孕不育患者做好遺傳咨詢,選擇合適的治療方案和技術。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2019年11月在山東大學附屬生殖醫院進行ART的91 908例患者(45 954對夫婦)為研究對象。納入標準:夫婦同時進行外周血染色體檢查和生殖激素檢測并獲得結果,男性進行精液檢測,女性進行取卵檢查。排除標準:臨床資料不全或未進行上述項目檢測者,夫婦染色體核型皆為多態性者。本研究經山東大學附屬生殖醫院倫理委員會批準,并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1染色體檢查 常規從患者肘正中靜脈抽取外周靜脈血1.0 mL,肝素抗凝,雙人核對后接種于裝有5 mL RPMI的1640培養管中,置于37 ℃恒溫培養箱中。培養68～72 h后加入40 μg/mL秋水仙素至終濃度為0.4 μg/mL,繼續培養1.5 h,采用染色體自動收獲儀制備懸液,常規滴片、烤片、胰酶消化和吉姆薩染色行G顯帶。GSL-120染色體全自動分析儀掃片后,依據相關標準進行染色體核型分析。對每個受檢者分析5個核型,計數20個分裂象,對于嵌合核型者加倍計數。

1.2.2精液檢查 男性患者禁欲2～7 d后手淫取精,30 min內體溫保溫送檢,精液標本接收后放在37 ℃恒溫水浴箱中進行液化,利用西班牙SCA精液分析儀,參照相關標準進行精液常規分析。

1.2.3生殖激素檢查 采用羅氏cobas e601型全自動電化學發光分析儀檢測卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、睪酮(T)、垂體催乳素(PRL)、雌二醇(E2)、促甲狀腺激素(TSH)水平,其中原裝配套試劑與質控品由羅氏醫療設備有限公司提供,具體步驟嚴格遵照說明書進行。

1.3統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行數據處理和統計學分析。不呈正態分布的計量資料以M(P25,P75)表示,組間比較采用秩和檢驗;計數資料以例數和百分率表示,組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1患者染色體核型檢測結果 在91 908例患者中共檢出染色體正常核型80 938例,占88.06%;染色體畸變核型3 852例,占4.19%;染色體多態性核型7 118例,占7.74%。其中,男性染色體畸變2 392例,占男性患者總數的5.21%,女性染色體畸變1 460例,占女性患者總數的3.18%;男性染色體多態性4 018例,占男性患者總數的8.74%,女性患者染色體多態性3 100例,占女性患者總數的6.74%。男性染色體畸變和多態性檢出率皆明顯高于女性(P<0.05)。見表1。

表1 患者染色體核型檢測結果

2.2男性染色體多態性患者各項指標比較 統計染色體多態性患者的精液、生殖激素和獲卵數的檢測結果,篩檢后染色體多態性組有4 434例(男2 280例,女2 154例)。將夫婦雙方染色體核型皆正常者設為對照組(1 189例),根據染色體多態性的不同形態,將男性染色體多態性患者進一步分為Y組(522例)、inv(9)組(223例)、D/G組(626例)、1qh+組(641例)、9/16組(268例)。與對照組比較,Y組精子濃度和精子總活力降低,FSH和LH水平升高,差異均有統計學意義(P<0.05),T和PRL在各組間比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。為進一步分析不同Y染色體核型的影響,將Y組進一步分為4組:Yqh-組(152例)、Yqh+組(283例)、inv組(33例)、qs組(13例)、del(Y)組(41例)。結果發現,Yqh+組數量最多,占Y組的54.21%,Yqh-組占29.12%。與縮減對照組比較,Yqh-組、del(Y)組精子濃度、精子總活力降低,FSH和LH水平升高,Yqh+組精子濃度、精子總活力降低,差異均有統計學意義(P<0.05),見表3。

表2 男性染色體多態性患者各項指標比較[M(P25,P75)]

表3 不同Y染色體多態性患者各項指標比較[M(P25,P75)]

2.3女性染色體多態性患者各項指標比較 根據染色體多態性的不同形態,將女性染色體多態性患者進一步分為inv(9)組(275例)、D/G組(859例)、1/9/16組(1 020例)。結果顯示,inv(9)組獲卵數低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05),FSH、LH、E2、T、PRL、TSH在各組比較,差異無統計學意義(P>0.05),見表4。

表4 女性染色體多態性患者各項指標比較[M(P25,P75)]

3 討 論

染色體多態性主要表現為異染色質區域的變異,特別是含有高度重復DNA的異染色質,其中DNA在分子水平上主要是“非編碼”的高度重復序列,為無轉錄活性的結構基因[2]。因此染色質多態性一直以來被認為是正常變異,沒有臨床病理意義[3]。但近年來研究表明,異染色質在維持染色體正常結構和功能中發揮重要作用。異染色質在著絲粒功能中發揮重要作用,是姐妹染色單體結合和染色體分離所必需的[4]。通過染色體重排,常染色質易位到異染色質會誘導常染色質異染色質化,抑制基因表達,從而導致患者不育[5]。已有報道表明,染色體多態性在普通人群中的發生率在2%～5%,在不孕不育人群中的發生率在10%～15%[6-7]。這說明染色體多態性與不孕不育的發生有一定的關系,染色體多態性會引起一定的臨床表現[8-10]。本研究對進行ART的不孕不育夫婦外周血染色體核型進行回顧性分析,發現染色體多態性患者占7.74%,該數值低于上述報道不孕不育患者染色體多態性的發生率,這原因可能與目前臨床普遍認為染色體多態性不影響生育從而不建議患者實施ART有關。本研究還發現男性染色體多態性的檢出率要高于女性,這可能與男性特有的Y染色體多態性有關[11]。

Y染色體多態性主要包括Yqh+、Yqh-和Y倒位。田艷等[12]研究表明,與健康對照組比較,Yqh+組、Yqh-組精子密度和精子總活力明顯降低。李磊磊[13]研究顯示,與精子濃度正常者比較,無精子癥、少精子癥患者Y染色體多態性占比有明顯差異,且隨著精子濃度的減少,Yqh+和Yqh-占比明顯增加。馮曉琴等[14]發現,Yqh-組的精子濃度明顯少于對照組。本研究結果顯示,Yqh+組和Yqh-組精子濃度和精子總活力都明顯低于對照組,表明Yqh+或Yqh-影響精子生成和精子活動,與上述研究結果一致。Yqh+是指Y染色體長臂異染色質區長度增加,該區域含有與精子分化和發育相關的基因,該區域過度重復會影響減數分裂時染色體的配對聯會,從而影響精子受精能力或生成[15]。Yqh-是指Y染色體長臂異染色質區長度減少,Y染色體異染色質減少,導致常染色質排列松散,或是由于DNA排列過密,造成基因功能的喪失[16]。汪小波等[17]發現部分Yqh-多態性在分子水平實為Y染色體微缺失,且認為未檢查到Y染色體微缺失的Yqh-可歸因于分子檢測標記的覆蓋度不足,提示臨床應對Yqh-的患者進一步行分子水平檢測。del(Y)是指Y染色體長臂部分缺失,屬于染色體結構異常,攜帶者主要表現為生精功能障礙[18]。臨床上將長度小于21號染色體的Y診斷為Yqh-,而del(Y)染色體長度往往也小于21號染色體,就導致在細胞水平上難以鑒別二者。本研究發現,與對照組比較,del(Y)組的精子濃度和精子總活力降低、FSH和LH水平升高,這與Yqh-組結果相同。該結果進一步說明分子水平檢測對鑒別del(Y)和Yqh-的重要性。

生理狀態下血清生殖激素水平受下丘腦-垂體-睪丸軸調控,睪丸具有內分泌功能,其間質細胞可分泌雄激素(主要是T),T的作用為啟動和維持生精。FSH作用于支持細胞,生成雄激素結合蛋白,從而維持T水平以促進精子成熟[19-20],LH主要促進睪丸間質細胞合成和分泌T,維持精子生成[21]。已有研究表明,Y染色體微缺失會影響睪丸的生精功能,使其不能分泌足夠的抑制素去調節FSH和LH水平,從而導致二者水平升高[22]。本研究發現del(Y)組、Yqh-組血清FSH、LH水平高于對照組,而PRL、T水平無明顯差異,臨床應該重視Y染色體多態性對男性生殖激素水平的影響。

人類6%～8%的異染色質分布于9號染色體上,導致9號染色體結構的高度多態性[14]。本研究同樣發現,女性染色體多態性患者9號染色體倒位與獲卵數有關,與生殖激素分泌水平無關,其他染色體多態性與獲卵數和生殖激素皆無關系。已有研究表明,9號染色體倒位可以抑制減數分裂轉錄因子和RNA聚合酶Ⅲ的功能[23],因而9號染色體倒位可導致相應區域的重排,影響相關基因的表達,從而影響母原細胞減數分裂產生卵子。本研究的發現再次提示臨床應該重視9號染色體倒位對卵子質量的潛在遺傳效應。

綜上所述,本研究中男性染色體多態性Yqh+、Yqh-與男性不育有關,女性染色體多態性9號染色體倒位對獲卵數有影響。臨床應該加大關注力度,進一步明確染色體多態性對于不孕不育患者的診療和輔助生殖的意義。