CD161流式細(xì)胞術(shù)對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核診斷效能的評(píng)價(jià)*

張雅曦,張明霞,楊倩婷,孟 娟,余志勇,陳 騎

深圳市第三人民醫(yī)院肝病研究所,廣東深圳 518112

結(jié)核病是危害全球公眾健康的一種常見(jiàn)的慢性傳染性疾病,感染途徑主要是通過(guò)呼吸道感染兼性胞內(nèi)致病結(jié)核分枝桿菌(TB)[1]。早期診斷和及時(shí)治療活動(dòng)性肺結(jié)核,可阻止結(jié)核病患者在社區(qū)內(nèi)的進(jìn)一步傳播。然而,通過(guò)病原學(xué)診斷疑似結(jié)核病患者可能需要很長(zhǎng)時(shí)間,花費(fèi)較高,導(dǎo)致臨床診斷滯后和治療延誤[2]。有研究表明,全球每年近1 040萬(wàn)例新發(fā)結(jié)核病病例和180萬(wàn)例死亡病例[3],因此,改進(jìn)和加快診斷評(píng)估手段仍然是結(jié)核病患者的臨床診斷和公共衛(wèi)生重點(diǎn)。

本課題組在前期工作中,利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)不同類(lèi)型的細(xì)胞表面分子和臨床標(biāo)本進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性肺結(jié)核患者CD161水平明顯低于健康者和潛伏感染者,并且流式細(xì)胞術(shù)能簡(jiǎn)單區(qū)分活動(dòng)性肺結(jié)核患者和健康者[4-5]。在此基礎(chǔ)上,為更有效區(qū)分不同類(lèi)型的結(jié)核病患者,利用目前流行的深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)建立分類(lèi)模型,探索CD161在活動(dòng)性肺結(jié)核中的輔助診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2020年4—12月在本院住院的268例確診為活動(dòng)性肺結(jié)核患者的臨床資料,其中痰涂片結(jié)果為陽(yáng)性(涂陽(yáng))的患者170例為涂陽(yáng)組,3次或以上痰涂片結(jié)果未見(jiàn)TB(涂陰)的患者98例為涂陰組,并對(duì)其中初治結(jié)核患者(47例)和耐多藥結(jié)核患者(37例)進(jìn)行跟蹤隨訪。另選取本院的體檢健康者138例為對(duì)照組。結(jié)核病患者診斷根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行[6],涂陽(yáng)患者:痰涂片為陽(yáng)性,診斷類(lèi)型為繼發(fā)性;涂陰患者:細(xì)菌學(xué)陰性,初治無(wú)合并其他傳染病、自身免疫性疾病;結(jié)核治愈患者:正規(guī)抗結(jié)核治療時(shí)間6個(gè)月以上,病原學(xué)檢測(cè)陰性,多次影像學(xué)胸部CT檢查無(wú)明顯變化,停止抗結(jié)核治療達(dá)到非活動(dòng)性肺結(jié)核或陳舊肺結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)。體檢健康者:均經(jīng)胸部X線或CT檢查,排除肺部結(jié)核及肺外部位結(jié)核,既往無(wú)結(jié)核史,無(wú)結(jié)核接觸史,未服用過(guò)抗結(jié)核藥物。

1.2儀器與試劑 全自動(dòng)熒光定量PCR儀(型號(hào):ABI-7500)購(gòu)自美國(guó)賽沛公司,酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(Elispot)試驗(yàn)讀板儀購(gòu)自美國(guó)CTL公司,細(xì)胞流式儀CantoⅡ購(gòu)自美國(guó)BD公司。TB-DNA核酸檢測(cè)試劑盒(批號(hào):20200801)購(gòu)自達(dá)安基因股份有限公司,GeneXpert檢測(cè)試劑盒(批號(hào):1000166969)購(gòu)自深圳市同春和生物科技有限公司,γ干擾素釋放試驗(yàn)(IGRAs)試劑盒(批號(hào):20200600905)購(gòu)自北京同生時(shí)代生物科技有限公司,流式CD161試劑盒(批號(hào):20200501)購(gòu)自深圳市聯(lián)合醫(yī)學(xué)科技有限公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 采用肝素鋰抗凝管采集受試者新鮮外周血8 mL用于Elispot試驗(yàn),采用乙二胺四乙酸二鉀抗凝管采集受試者新鮮外周血2 mL用于流式CD161檢測(cè),結(jié)核病患者留取有效晨痰3～4份標(biāo)本用于細(xì)菌學(xué)檢測(cè)。

1.3.2流式細(xì)胞術(shù) 流式結(jié)果用軟件FlowJo進(jìn)行分析,分別圈出單核細(xì)胞(CD45+CD64+)、淋巴細(xì)胞(CD45+CD64-)、CD161+細(xì)胞(CD45+CD64-CD161+),最后得出單核細(xì)胞比例(M%)、淋巴細(xì)胞比例(L%)和CD161陽(yáng)性淋巴細(xì)胞比例(CD161+%)。

1.3.3深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建及運(yùn)算 跟據(jù)深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)模型的訓(xùn)練機(jī)制,將數(shù)據(jù)集按照4∶1的比例隨機(jī)劃分為訓(xùn)練集和測(cè)試集,以擬合出網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)該數(shù)據(jù)的最佳性能。深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建采用用TensorFlow的Keras數(shù)據(jù)庫(kù),建立4層序貫式神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。輸入層為3個(gè)維度,即M%、L%和CD161+%;隱藏層包括3層全連接層,激活函數(shù)均為修正線性單元(ReLu),其中第2層為隨機(jī)失活droupout層[5];最后1層為輸出層,激活函數(shù)為sigmoid,優(yōu)化器為Adam,輸出類(lèi)別為T(mén)B。模型默認(rèn)以0.45為判斷值,即每個(gè)標(biāo)本預(yù)測(cè)概率值(OR)≥0.45為結(jié)核病患者,否則為健康者。模型性能評(píng)判指標(biāo)包括受試者工作特征(ROC)曲線、靈敏度、特異度、準(zhǔn)確率等。

2 結(jié) 果

2.1不同檢測(cè)方法在活動(dòng)性肺結(jié)核中的診斷效能 結(jié)果顯示,GeneXpert在涂陽(yáng)組和涂陰組中的檢出率分別為87.65%、28.57%,TB-DNA的檢出率分別為81.18%、20.41%,痰培養(yǎng)的檢出率分別為60.00%、24.48%,Elispot試驗(yàn)的檢出率分別為85.29%、64.28%。見(jiàn)表1。

表1 不同檢測(cè)方法在活動(dòng)性肺結(jié)核中的診斷效能[n(%)]

2.2基于流式細(xì)胞術(shù)的深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建與運(yùn)算 結(jié)果顯示,各組L%、CD161+%、M%、OR比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。通過(guò)大量數(shù)據(jù)在訓(xùn)練集上構(gòu)建深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)模型,發(fā)現(xiàn)模型能很好鑒別涂陽(yáng)組和對(duì)照組,測(cè)試集的ROC曲線下面積(AUC)為0.87(95%CI0.84～0.91),準(zhǔn)確率為0.82,靈敏度為0.77,特異度為0.84;鑒別涂陰組和對(duì)照組的AUC為0.79(95%CI0.73～0.85),準(zhǔn)確率為0.71,靈敏度為0.71,特異度為0.84。見(jiàn)表3、圖1。

圖1 深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)各組的診斷效能

表2 各組L%、M%、CD161+%、OR比較

表3 深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)各組的診斷效能

2.3深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)模型在抗結(jié)核治療指標(biāo)的評(píng)估 Elispot試驗(yàn)在涂陽(yáng)結(jié)核、涂陰結(jié)核和結(jié)核治愈患者中的檢出率分別為85.29%、64.28%、61.50%,而深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)模型的檢出率分別為77.05%、71.42%、16.84%。

為了驗(yàn)證深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)模型在抗結(jié)核治療中的動(dòng)態(tài)表現(xiàn),隨訪了84例活動(dòng)性肺結(jié)核患者,其中初治結(jié)核47例,耐藥結(jié)核37例。在治療0、3、6個(gè)月時(shí)檢測(cè)L%、M%和CD161+%,并在測(cè)試集上驗(yàn)證,閾值≥0.45為陽(yáng)性。結(jié)果顯示,初治結(jié)核患者0、3、6個(gè)月時(shí)OR均值分別為0.741、0.433、0.304,檢出率分別為82.97%、46.80%、19.10%;耐藥結(jié)核患者OR均值分別為0.683、0.520、0.525,檢出率分別為72.90%、48.64%、51.35%。見(jiàn)表4。

表4 深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)模型在抗結(jié)核治療指標(biāo)的評(píng)估

3 討 論

早發(fā)現(xiàn)、早治療是所有傳染性疾病的防控策略,是消除疾病和降低疾病病死率的重要手段。然而目前的醫(yī)學(xué)研究水平對(duì)于結(jié)核病的早期快速診斷和短程高效治療略有延遲或不足,流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,新增感染、耐多藥結(jié)核例數(shù)及結(jié)核病病死率逐年增長(zhǎng)有諸多因素,但缺乏快速、早期診斷結(jié)核病感染的方法是關(guān)鍵的原因之一[6]。無(wú)法早期有效治療和有效控制傳染源,可導(dǎo)致結(jié)核病快速間接或直接傳播擴(kuò)散。

研究結(jié)核病早期、快速、特異、靈敏且低費(fèi)用的檢測(cè)方法和手段是實(shí)驗(yàn)室的終極目標(biāo)。目前臨床為準(zhǔn)確診斷結(jié)核病,聯(lián)合多指標(biāo)、多手段來(lái)解決診治難的問(wèn)題。其中分子生物學(xué)GeneXpert檢測(cè)技術(shù)具有較高的特異度和靈敏度,TB-DNA等方法可極大提高有痰液結(jié)核病患者的確診率[7-8]。在檢出涂陽(yáng)患者的各種方法學(xué)中,GeneXpert特異度較高,但缺點(diǎn)是臨床有部分無(wú)痰液患者無(wú)法檢測(cè)[9];IGRAs法檢測(cè)標(biāo)本易得,可以區(qū)分健康者和潛伏感染者,但無(wú)法鑒別活動(dòng)性肺結(jié)核和潛伏感染者[10-11];微創(chuàng)支氣管纖維鏡能使臨床醫(yī)生更直觀了解TB引起的肺部病灶,其中肺泡灌洗液的TB培養(yǎng)可提高無(wú)痰患者、涂陰患者的檢出率[12-13]。因此,聯(lián)合診斷可提高檢出率,減少漏檢,但高昂費(fèi)用和檢測(cè)平臺(tái)的建立并無(wú)普及優(yōu)勢(shì)。

CD161被認(rèn)為是Th17細(xì)胞的標(biāo)志物[14-15],Th17細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素-17A和白細(xì)胞介素-17F兩種前炎癥因子在TB清除中起到重要作用[16-17]。CD161表達(dá)細(xì)胞另一個(gè)重要的基團(tuán)是黏膜相關(guān)恒定的T淋巴細(xì)胞(MAIT)[17-19],在宿主病原體防御中發(fā)揮重要作用,尤其是與重癥患者細(xì)菌感染炎癥密切相關(guān)[20]。本研究基于CD161流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果,通過(guò)人工智能算法建立判斷方法,其檢測(cè)結(jié)果更為客觀。目前的研究認(rèn)為單指標(biāo)的診斷有較大的局限性,其靈敏度和特異度還有待提高。因此,研究人員嘗試通過(guò)組合不同的標(biāo)志物建立人工智能分類(lèi)模型提高檢出率。而作為機(jī)器學(xué)習(xí)的分支,深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)模型在復(fù)雜問(wèn)題上更具優(yōu)勢(shì),且不需要太關(guān)注特征工程相關(guān)工作[21]。研發(fā)高效、人工智能化、快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的檢測(cè)方法可為結(jié)核病的防控提供有力的支持。

利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD161、淋巴和單核細(xì)胞的比例,結(jié)合深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)模型,能有效分辨出健康者及結(jié)核病患者,其鑒別健康者和涂陽(yáng)患者的靈敏度、特異度分別為0.77、0.84,鑒別健康者和涂陰患者的靈敏度、特異度分別為0.71、0.84,在涂陰患者中的準(zhǔn)確率(即檢出率)為0.71。而痰培養(yǎng)、GeneXpert、TB-DNA、Elisopt在涂陰患者中的檢出率分別為24.49%、28.57%、20.41%、64.29%,提示該技術(shù)在涂陰結(jié)核中的檢出率明顯高于其他檢測(cè)方法的檢出率。這些結(jié)果提示,該檢測(cè)方法對(duì)于涂陰結(jié)核患者的診斷有輔助效能。

目前關(guān)于結(jié)核病治療效果的判斷,臨床上主要依靠臨床癥狀的改變及影像學(xué)的變化判斷,因此非常依賴臨床醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)。本研究發(fā)現(xiàn)CD161流式細(xì)胞術(shù)對(duì)于結(jié)核病治療療效有一定的指導(dǎo)意義,其CD161評(píng)分(OR均值)在結(jié)核治愈患者(治療6個(gè)月)較結(jié)核病患者(治療0個(gè)月)降低,提示結(jié)核治愈患者中CD161可隨體內(nèi)TB的清除,而降至正常水平。其中初治患者在抗結(jié)核治療3個(gè)月OR均值開(kāi)始明顯下降,6個(gè)月降至正常范圍。然而,耐藥結(jié)核患者OR均值維持在較高水平,與患者病情保持一致。因此,通過(guò)監(jiān)測(cè)CD161的變化可以提示在結(jié)核病治療中的不同人群是否已達(dá)到治愈或非活動(dòng)性肺結(jié)核標(biāo)準(zhǔn),減少抗結(jié)核藥物對(duì)各組織器官帶來(lái)的損傷。

綜上所述,本研究結(jié)果表明以CD161為標(biāo)識(shí)的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)智能模型可作為輔助診斷技術(shù),在指導(dǎo)臨床抗結(jié)核治療用藥時(shí)間及非活動(dòng)性肺結(jié)核復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)中具有參考價(jià)值。當(dāng)然本研究只是小樣本的檢測(cè)結(jié)果,下一步需要擴(kuò)大樣本進(jìn)行多中心的檢測(cè)證實(shí)研究的可行性。