MALDI-TOF系統在鑒定流感嗜血桿菌中的應用價值

黃利美

天津市河東區疾病預防控制中心 300151

流感嗜血桿菌是導致細菌性感染的主要致病菌,其檢出率處于革蘭陰性菌的第2位[1]。該病菌主要分布在人體的咽部、鼻部及鼻咽部,常會引起肺炎、急性鼻竇炎、中耳炎等疾病,甚至會導致中樞神經系統感染[2]。長期以來,受醫療條件的限制,使該病菌檢出率處于較低水平。細菌培養、生化鑒定方法是鑒定流感嗜血桿菌的主要方法,但細菌培養檢測時間長,生化檢驗干擾因素多,均難以滿足大量樣本的檢測需求。隨著檢測水平的發展,實時熒光PCR(Rt-PCR)技術逐漸用于臨床,具備快速、易操作、敏感度高、高通量等優勢,明顯提高臨床檢測水平[3]。但關于Rt-PCR試劑盒的質量控制及相關評價,尚無標準。全自動快速微生物質譜檢測系統(MALDI-TOF)是通過基質輔助激光解吸飛行時間質譜來實現對菌種蛋白質組學的快速檢測,在病原菌快速鑒定中得到廣泛應用[4]。現本文分析MALDI-TOF系統在鑒定流感嗜血桿菌中的應用價值,報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選取2020年1—6月于醫院住院或門診就診患者的痰液標本或咽拭子標本1 200份,其中男638例,女562例;年齡6～74(42.35±5.28)歲。納入標準:(1)納入患者均為呼吸道感染;(2)所采集的標本未污染;(3)具有完整的臨床資料及檢測資料。排除標準:(1)合并中樞神經系統感染、菌血癥等嚴重感染者;(2)伴惡性腫瘤者;(3)近期接受免疫抑制劑或糖皮質激素治療者。

1.2 方法 采集1 200份痰液標本或咽拭子標本進行細菌分離培養,參加研究的檢驗人員經驗豐富、技術嫻熟,均在同一批檢測儀器上進行。檢測儀器與設備:嗜血巧克力平板(江門凱琳),V+X因子(英國OXOID公司);ABI9700 PCR 儀;VITEK MS質譜儀(法國梅里埃);全自動細菌鑒定儀及配套試劑卡片(法國梅里埃)。常規生化細菌鑒定系統:細菌培養:將采集的痰液標本或咽拭子標本接種于嗜血巧克力平板上,培養時間為18～24h,培養條件:35℃;5.0%CO2培養箱;若菌株在血平板上不生長,或呈生長不良狀態,巧克力平板上出現的菌落呈灰白、大小中等,透明或半透明,濕潤,染色鏡檢為革蘭陰性短小桿菌,則可考慮為嗜血桿菌。(1)MALDI-TOF檢測系統:選取細菌培養后的某單個菌落數,涂抹在質譜儀金屬靶板上,添加培養基質液,在質控點添加大腸埃希菌ATCC8739,添加配套基質液,靜置3min,待干燥后,將樣品板放置質譜儀中鑒定。鑒定結果可靠:鑒定結果處于60.0%～99.9%(綠色),黃色:低分辨率,有2～4個鑒定結果,可信率>60%,需進一步鑒定;紅色:無法鑒定,可信率≤60%。(2)M-H瓊脂試驗:按照V、X因子需求試驗檢測,選取某個單菌落涂在培養基內,分別粘貼V+X因子、X、V因子試片內,置于6%～12%CO2培養箱進行培養24h,若V+X因子周圍生長,則判斷流感嗜血桿菌。(3)16SrDNA檢測:采用16SrDNA 序列測序作為流感嗜血桿菌檢測金標準,DNA提取檢測試劑盒提取相應模板,對16SrDNA片段做PCR擴增檢測,若檢測結果為陽性時再采用DNA序列測序,并與資料庫內的序列資料進行比較,若相似度>99%,可判斷為同種類細菌。

1.3 觀察指標 (1)比較三種檢測方法對流感嗜血桿菌的檢出率,以16SrDNA 序列測序檢測結果為金標準,判斷三種方法之間的差異;(2)比較三種檢測方法的檢測所需時間;(3)比較檢測人員對三種檢測方法的滿意度:包括檢測時間、檢測流程、檢測結果判讀、檢測成本4個維度進行評價,共抽查20名檢測人員,每個維度計0～10分,評分越高,檢測滿意度越高。

2 結果

2.1 三種檢測方法對流感嗜血桿菌檢出率比較 1 200份痰液標本或咽拭子標本采用16SrDNA 序列測序檢測后,剔除同一個患者重復分離的菌株后,得到45株流感嗜血桿菌。MALDI-TOF檢測系統對流感嗜血桿菌檢出率最高,依次是常規生化細菌鑒定系統、M-H瓊脂藥敏試驗法,其中MALDI-TOF檢測系統檢出率高于M-H瓊脂藥敏試驗法,差異有統計學意義(P<0.05),但與常規生化細菌鑒定系統比較差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 三種檢測方法對流感嗜血桿菌檢出率比較[n(%)]

2.2 三種檢測方法檢測所需時間比較 三種方法檢測系統檢測流感嗜血桿菌所需時間顯示:MALDI-TOF檢測系統<常規生化細菌鑒定系統

表2 三種檢測方法檢測所需時間比較

2.3 三種檢測方法滿意度比較 MALDI-TOF檢測系統對檢測時間、檢測流程、檢測結果判讀、檢測成本的滿意度最高,其次是常規生化細菌鑒定系統、M-H瓊脂藥敏試驗法,差異有統計學意義(P<0.05),見表3。

表3 三種檢測方法滿意度比較分)

3 討論

流感嗜血桿菌是引起呼吸道感染性疾病的主要病原菌,對生長營養的要求較高。韋忠廳等[5]研究調查發現5 241例呼吸道感染患兒中對流感嗜血桿菌檢出率為22.50%。而且近年來,流感嗜血桿菌感染率日益增加,受呼吸道正常菌群及抗生素濫用的影響,使其檢出率較低,且不同檢測方法的分離率差異較為明顯,使其漏檢率較高[6]。常規生化細菌培養法是臨床診斷病原菌的常用方法,但其操作復雜,檢測時間長達6～24h,而且菌株傳次數會影響檢測生化反應,導致檢測結果出現生長不良或生化反應不顯著等情況[7]。同時細菌培養法結果判斷時多依靠肉眼觀察,主觀性較強,故會影響細菌檢出率。隨著臨床診斷技術的發展,各種診斷方法層出不窮,其中M-H瓊脂實驗法及MALDI-TOF檢測系統的出現,操作簡單,價格成本相對較低,故而能提高臨床診斷水平[8]。

本文結果顯示,MALDI-TOF檢測系統對流感嗜血桿菌的檢出率為97.78%,高于M-H瓊脂藥敏試驗法的75.56%(P<0.05),但與常規生化細菌鑒定系統檢出率88.89%比較差異無統計學意義(P>0.05)。與秦淑國等[9]研究類似,其顯示MALDI-TOF檢測系統菌株檢出率為96.67%高于M-H瓊脂試驗的73.33%,而與細菌培養法的86.67%相比無顯著差異。故采用MALDI-TOF檢測系統鑒定流感嗜血桿菌具有較高檢出意義。且檢測時間相比,MALDI-TOF檢測系統檢測時間最短(僅在幾分鐘內即可得出結果),其次是細菌培養法(6～24h),最后是M-H瓊脂藥敏試驗法(24～48h)。袁君君[10]研究結果也與本文結果相一致。故說明MALDI-TOF檢測系統診斷流感嗜血桿菌,檢出率高,檢測時間短。分析原因細菌培養作為病原菌診斷的常用方法,容易受實驗室環境、操作人員的主觀判斷能力的影響,導致診斷結果差異。MALDI-TOF檢測系統主要是通過對比已知菌種建立數據庫,將檢測獲得的微生物蛋白質圖譜與數據庫內的微生物圖譜進行對比,操作簡單,檢測結果自動顯示,耗費成本低,操作人員及患者無需等待較長時間,檢測不受主觀因素影響,結果判讀更加客觀,以此能提高病菌檢出率[11];M-H瓊脂藥敏試驗操作簡單,無需特殊儀器,但其耗材成本高于MALDI-TOF檢測系統,需要肉眼判斷結果,進而會導致結果判斷的主觀性;同時該方法對培養環境要求高,技術人員經驗、操作水平參差不齊等,均會降低流感嗜血桿菌檢出率;另外該檢測方法操作檢驗步驟煩瑣、復雜,檢測時間長,且傳代次數增加會影響生化反應結果,從而導致流感嗜血桿菌檢出率降低[12]。

本文結果發現,MALDI-TOF檢測系統對檢測時間、檢測流程、檢測結果判讀、檢測成本的滿意度最高,其次是常規生化細菌鑒定系統、M-H瓊脂藥敏試驗法,差異有統計學意義(P<0.05)。結果表明實驗室操作人員在診斷流感嗜血桿菌時,更傾向于采用MALDI-TOF檢測系統,滿意度高。主要是細菌培養、M-H瓊脂藥敏試驗操作步驟煩瑣、耗費成本相對較高,等待時間長、需要自主結果判讀,從而會增加檢測人員的工作負擔;而采用MALDI-TOF檢測系統,只根據細菌、真菌特性蛋白質指紋圖譜進行鑒定,儀器自動出檢測結果,只需要幾分鐘的檢測時間,實現微生物的快速鑒定,從而能減輕檢測人員的工作負擔,降低人為因素導致的檢測結果誤差,滿足大樣本量檢測,故而能減輕操作負擔,明顯提高檢測效率及工作滿意度[13]。

基于此,得出結論,MALDI-TOF檢測系統鑒定時間僅需要幾分鐘,無須特殊操作,成本低、自動判讀結果,不受主觀因素影響,故能明顯提高樣本檢測準確性。但其檢測準確性仍未達到100%,可能是嗜血桿菌的數據庫還未徹底完善;同時菌落與基質液共結晶的均勻程度、基質液保存時間等,均會影響流感嗜血桿菌的檢出結果。因此MALDI-TOF檢測系統鑒定準確性依賴于數據庫內菌種圖譜的信息量,需要醫務工作者深入研究,增加菌種圖譜信息。

綜上所述,全自動快速微生物質譜檢測系統鑒定流感嗜血桿菌的應用價值高,檢測時間短,檢出率高,可明顯減輕檢測人員的工作負擔,降低人為因素導致的檢測結果誤差,明顯提高檢測效率及工作滿意度,值得臨床應用。