人牙髓細胞與PLGA微球材料復合構建后的形態學觀察*

王冠華 鄒慧儒 連小麗 代曉華 顏 艷 張林樸

天津市口腔功能重建重點實驗室 天津市口腔醫院 南開大學醫學院 300041

牙髓根尖周病作為常見病、多發病,危害人類健康。傳統治療方法存在著許多的問題,因此需要尋找一種新的治療方法。牙髓—牙本質復合體的作用在于能夠有效保持牙齒的健康,維持機體的正常功能。因此在臨床中探尋組織工程牙髓—牙本質復合體是非常重要的,它能夠有效恢復牙齒的正常功能,因此組織工程化牙髓—牙本質復合體是當下國內外學者熱衷于研究的課題。 目前PLGA應用于骨組織工程的研究很多。有人將PLGA納米復合材料用于成骨細胞也觀察到明顯的增殖和分化[1]。但很多研究所選取的種子細胞來源于動物,而本研究選取的種子細胞是人牙髓細胞,這樣對于后期組織工程材料用于臨床更加具有評估價值。本文最后一個最重要的研究工作目的是探討如何實現將人牙髓細胞與可被植入的注射型牙支架材料聚乳酸二酐酯/聚二苯羥基二丙乙酸共聚物(Polylactic-co-glycolic acid),構建復合體后,通過掃描電鏡及免疫組織化學等方法進行組織形態學鑒定,同時監測PLGA微球與牙髓細胞培養的狀況,從而通過研究獲得結論,明確微球的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本次研究通過了醫院的審批認可,患者是自主參與到本次研究之中的,收集正畸或阻生拔除的新鮮健康前磨牙或第三磨牙,αMEM培養基(美國,Gibico);胎牛血清(中國,灝洋生物);胰蛋白酶(美國,Sigma);牙本質涎磷蛋白(英國,Abcam);牙本質基質蛋白(英國,Abcam);Ⅰ型膠原(英國,Abcam);細胞培養箱(美國,Thermo);超凈工作臺(中國,海爾);倒置顯微鏡(日本,Nikon);細胞培養板(美國,Corning);細胞培養瓶(美國,Corning);可調微量加樣槍(美國,Gilson);正置顯微鏡(日本,Nikon);掃描電鏡(日本,捷歐路)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 聚乳酸/羥基乙酸共聚物微球的制備。在臨床展開探究分析時首先將濃度不同的NH4HCO3溶液(W1相)(1.25ml)分別加入濃度不同的PLGA有機溶液中(O相)(4ml),在4℃環境之下通過應用勻漿機乳化得到初乳液(W1/O)。之后將勻漿所得初乳液倒入150ml 0.1%的PVA水溶液中(W2相),隨后通過攪拌機再次攪拌并獲得二次乳液(W1/O/W2),在此過程當有機物揮發之后便得到了PLGA多孔微球,將PLGA微球應用蒸餾水反復洗滌。應用過量的2mol/L的乙二胺水溶液將PLGA微球重懸,在室溫環境之下攪拌半個小時,將獲得的產物用蒸餾水進行多次清洗,以便能夠徹底清除乙二胺溶液。隨后將獲得的微球浸泡在濃度為0.5%的膠原溶液中,放置在4℃環境下12h之后再用蒸餾水反復沖洗。最后將微球浸泡于含20%胎牛血清的α-MEM培養液中,將其放置在4℃環境下12h并進行分裝。

1.2.2 人牙髓細胞原代培養及與三維材料的復合培養。本次研究通過了醫院的審批,且患者均為自主參與。收集正畸或阻生拔除的新鮮健康前磨牙或第三磨牙,隨后分離培養人牙髓細胞,并將其放置在含有20%胎牛血清的培養基內7～10d,隨后通過顯微鏡觀察細胞狀況,根據細胞生長情況定期換液觀察,原代細胞達到80%以上時,通過使用0.25%胰蛋白酶特異性的作用于細胞并使細胞增殖生長。取第3～4代牙髓細胞展開特異性的實驗并將其和PLGA微球共培養,目的為能夠獲得組織工程化牙髓—牙本質復合體。按照不同的濃度將牙髓細胞接種于PLGA微球表面,三組細胞的接種濃度依次分別為2×105細胞/ml、1×105細胞/ml、5×104細胞/ml。將微球材料與牙髓細胞復合培養8周,每隔2d更換培養液,同時要定期檢測其形態變化狀況。

1.2.3 免疫組織化學染色。牙髓細胞與PLGA支架材料復合培養8周后進行免疫組化染色,石蠟切片脫蠟至水,首先應用2%的雙氧水阻斷內源性過氧化物酶,再應用1g/L胰酶37℃消化30min,最后分別滴加1∶200稀釋的牙本質涎磷蛋白(DSPP),1∶200稀釋的牙本質基質蛋白(DMP-1)和1∶100稀釋的Ⅰ型膠原(COLⅠ)三種抗體對樣本進行一抗的孵育,4℃孵育過夜。第2天滴加二抗繼續進行孵育,37℃孵育30min。蘇木素染色后進行脫水封片處理。并將正常牙齒切片作為陽性對照,PBS替代一抗孵育作為實驗的陰性對照。所有經過HE染色的切片都應用正置顯微鏡進行觀察并保留圖片。同時每個抗體選取一張圖片,每個圖片任意選取四個區域計數陽性率。

1.2.4 掃描電鏡觀察超微結構。牙髓細胞與微球材料共培養8周后終止培養。將細胞與生物材料構建的復合物用4%戊二醛4℃固定后,經過乙醇梯度脫水,冰凍干燥,真空噴金后,用JEOL-6700F掃描電鏡觀察。

2 結果

2.1 位相差倒置顯微鏡觀察結果 牙髓細胞與PLGA微球共培養2周后在顯微鏡下觀察牙髓細胞將微球材料捕獲形成三維立體結構,單純材料組有個別微球發生降解。共培養3周后,部分區域細胞向一側發生移動,牙髓細胞向材料方向生長。共培養8周后細胞發生卷疊包繞材料生長,形成材料和細胞的復合結構,部分微球材料不再是球狀,材料周圍出現凹陷,有的材料形態發生改變,外形不規則,說明材料發生了進一步降解。見圖1。

a b

2.2 電子顯微鏡下觀察結果 掃描電鏡結果顯示細胞與微球材料共培養8周后,單純材料組微球材料形態發生改變,材料表面部分區域出現凹陷,球狀材料外形不再是圓形,發生了不規則的改變,以上的結果都顯示出材料可能已經發生降解(見圖2a)。牙髓細胞與PLGA微球共培養組可見三維立體結構的牙髓細胞-PLGA微球復合體形成,牙髓細胞形態良好,細胞與材料融合生長(見圖2b)。

a b

2.3 免疫組化染色結果 免疫組化染色(HE)結果顯示牙本質涎磷蛋白(DSPP)、牙本質基質蛋白(DMP-1)和Ⅰ型膠原(COLⅠ)三種抗體皆為陽性表達,即細胞漿內有很多棕黃色顆粒,說明細胞中有大量的上述三種蛋白能夠大量表達。同時正常牙本質染色結果也為陽性表達。而空白對照組結果顯示上述三種抗體表達均為陰性。同時由于實驗組根據細胞濃度分為三組,免疫組化結果顯示細胞播種濃度最高組較其他兩個實驗組染色陽性表達更加明顯。但統計學結果顯示這兩個濃度組的陽性率比較差異無統計學意義。三個抗體相比較COLⅠ顯示的陽性結果稍弱,而DMP-1顯示的陽性結果最為明顯。而抗體相同、不同組別之間的臨床差異并不顯著,不具備統計學價值。

3 討論

當下許多國內外研究學者合成以PLA為主的共聚物,其中聚乳酸—羥基乙酸共聚物的作用較為突出,它有良好的生物降解性[2]。這種物質在水解之后的產物為乳酸和羥基乙酸,最后能夠被人體代謝,因此它不僅對人體沒有毒性,而且長期或者多次給藥都不會造成體內沉積[3],有學者在研究后指出介孔分子篩SBA15/PLGA復合后的支架材料可以用于骨重建的應用[4]。另外有人應用MC-3T3細胞與材料共培養用來比較單純PLGA支架及PLGA與膠原混合的支架材料的特性,結果發現PLGA與膠原混合的支架材料與細胞復合培養后具有更加明顯的生物學活性[5]。同時也有學者對復合加入膠原的PLGA材料進行研究也發現與單純細胞相比前者與細胞的黏附能力更強[6]。

本研究前期將PLGA微球和牙髓細胞復合培養并進行了堿性磷酸酶及雙鏈DNA等量化檢測,結果顯示1×105細胞/ml牙髓細胞接種于PLGA微球,細胞dsDNA含量及ALP活性水平較高。說明這個細胞的播種濃度更加適合細胞和微球材料增值結合,通過量化檢測初步證明了PLGA微球作為一種可注射支架材料,有利于牙髓細胞黏附生長[7]。而本次研究將PLGA微球與牙髓細胞復合培養構建組織工程化牙髓—牙本質復合體,并對組織工程化的復合體進行形態學觀察,結果發現倒置顯微鏡下形態學觀察不同播種濃度組的細胞與微球材料復合培養,初始階段均發生細胞沉降,細胞黏附于微球表面以及培養孔底壁。而隨著培養時間的逐步推移細胞和材料之間的連接度越來越高,說明了PLGA微球材料與細胞的相容性良好。

在牙本質基質的非膠原蛋白成分中,牙本質涎磷蛋白(DSPP)是一種非膠原蛋白,牙本質發育不全可能與DSPP基因突變有關。牙本質基質蛋白(DMP-1)主要在成牙本質細胞中特異性的表達,其作用在于能夠特異性的促進骨細胞和成牙本質細胞成熟。COLⅠ在臨床中通常會被應用于骨組織工程修復,不僅如此其還是成牙本質細胞表達的一種標志。因此這三種抗體都是牙本質再生的標志性抗體。有學者進行牙髓組織工程研究中應用PCR等方法對DSPP、DMP1的表達水平進行了檢測[8]。也有國外學者在進行牙髓細胞分化研究中對DSPP、DMP1等進行定量檢測,從而觀察牙髓細胞具體分化的情況[9]。另外有國外的研究人員將加入地塞米松的羥基磷灰石位于與牙髓細胞復合后通過檢測DSPP、DMP1等水平來觀察復合體的成牙本質分化情況[10]。而本實驗是通過免疫組化染色的方法對三種蛋白的表達進行觀察的,結果比較直觀。本次實驗結果顯示牙本質涎磷蛋白(DSPP)、牙本質基質蛋白(DMP-1)和膠原Ⅰ(COLⅠ)三種抗體表達都為陽性,說明細胞和材料復合體中含有大量的上述三種蛋白,與陽性對照組的牙本質區域上述三種抗體表達結果一致(正常對照為正常牙齒切片),充分說明了牙髓與PLGA微球構建的復合物具有成牙本質特性。另外,免疫組化結果顯示不同播種濃度的牙髓細胞與PLGA微球構建的牙髓—牙本質復合體免疫組化陽性結果程度不同,細胞播種濃度高的實驗組免疫組化染色結果陽性更加明顯。但計算陽性率結果差異無統計學意義,這可能是由于這幾種蛋白都是分泌型蛋白,除了成功構建的復合體含有上述這些蛋白以外,細胞外和材料中都有蛋白的分泌,因此免疫組化染色后觀察都有陽性反應,這在統計陽性率時有一定的影響,因此可能造成了對不同濃度的復合物陽性率統計時的誤差。雖然免疫組化結果不能確定隨著細胞濃度的增加這三種蛋白的表達會更加明顯,但目前的結果顯示三種蛋白的表達都有明顯的陽性結果,這樣依然可以說明PLGA微球材料適合人牙髓細胞的增殖生長。而三個播種濃度組的免疫組化結果都顯示支架材料發生了降解。通過上述研究并結合前期研究中堿性磷酸酶和雙鏈DNA的檢測結果,充分說明了與PLGA微球復合后的牙髓細胞具有成牙本質的特性,牙髓細胞與PLGA支架材料復合培養效果良好,在下一步工作中希望能對支架材料PLGA微球進一步進行改性,以便使其更加適合于組織工程化牙髓的構建,因此PLGA微球材料作為牙髓組織工程的材料具有很大的應用潛能。