急性腦梗死患者外周血Keap1-Nrf2/ARE信號通路變化與預(yù)后的相關(guān)性分析

張歡,祝善堯,葛偉,洪斌,劉爽

近年來,隨著溶栓、介入等再灌注治療手段的迅速發(fā)展,急性腦梗死(acute cerebral infarction,ACI)的治療效果得到顯著提高,但臨床實踐中仍有部分患者遺留不同程度神經(jīng)功能缺損,難以獲得良好的預(yù)后[1-2]。有研究統(tǒng)計,ACI患者靜脈溶栓治療后近期預(yù)后不良發(fā)生率高達42.70%,需給予重視[3]。因此,及早有效預(yù)測ACI患者預(yù)后情況成為研究熱點。目前,大量研究表明,ACI患者發(fā)生發(fā)展過程中與神經(jīng)功能缺損相關(guān)的環(huán)節(jié)較多,包括氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等[4-5]。其中,Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Kelch-like epichlorohydrin-related protein-1,Keap1)-核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2 correlation factor 2,Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant reaction element,ARE)是一種調(diào)控機體氧化應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)節(jié)下游氧化/抗氧化因子表達的重要信號通路,能維持腦梗死后細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)[6]。但關(guān)于該信號通路與ACI患者預(yù)后的關(guān)系仍缺乏確切的證據(jù)。為此,現(xiàn)分析ACI患者Keap1-Nrf2/ARE信號通路變化與預(yù)后的相關(guān)性,旨在為臨床預(yù)測預(yù)后提供更多思路,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2020年6月—2022年3月安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科診治 ACI患者110例作為研究對象,其中男63例,女47例,年齡48～85(66.92±3.66)歲;梗死部位:前循環(huán)68例,后循環(huán)42例;神經(jīng)功能缺損評分(National Institutes of Health Stroke Score,NIHSS)5～22(14.97±2.19)分;發(fā)病至溶栓時間1～4.5(2.73±0.41)h。根據(jù)溶栓后3個月改良Rankin量表評分評估短期預(yù)后,近期預(yù)后良好患者78例,mRs評分(1.81±0.17)分,近期預(yù)后不良患者32例,mRs評分(3.35±0.33)分;隨訪1年,失訪6例,根據(jù)ACI是否復(fù)發(fā)統(tǒng)計,遠(yuǎn)期預(yù)后良好患者83例,mRs評分(1.75±0.24)分,遠(yuǎn)期預(yù)后不良患者21例,mRs評分(3.24±0.31)分。近、遠(yuǎn)期預(yù)后良好患者mRs評分低于近、遠(yuǎn)期預(yù)后不良患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=32.212、23.898,P均<0.001)。遠(yuǎn)期預(yù)后良好患者83例,男48例,女35例,年齡48～85(65.83±4.12)歲;發(fā)病至溶栓時間1～4.5(2.65±0.51)h;誘因:情緒劇烈波動35例,勞累26例,精神緊張15例,其他7例;合并癥:高血壓15例,糖尿病9例,高脂血癥12例。遠(yuǎn)期預(yù)后不良患者21例,男12例,女9例,年齡49～85(67.01±4.54)歲;發(fā)病至溶栓時間1～4.5(2.77±0.53)h;誘因:情緒劇烈波動10例,勞累6例,精神緊張3例,其他2例;合并癥:高血壓5例,糖尿病3例,高脂血癥4例。2組一般資料比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2020031286),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):發(fā)病4.5 h內(nèi),CT檢查無責(zé)任腦梗死病灶;符合ACI相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];具備靜脈溶栓指征;無顱腦既往治療史。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):合并腦出血、腦外傷等其他顱腦疾病的患者;參與本研究4周前有服用免疫抑制劑、抗凝等藥物的患者;伴有嚴(yán)重全身性疾病的患者;存在凝血功能障礙、自身免疫疾病、呼吸道疾病的患者;合并惡性腫瘤的患者。

1.3 治療與分組 患者入院后均根據(jù)實際情況給予相應(yīng)對癥治療與支持治療;發(fā)病4.5 h內(nèi)給予阿替普酶靜脈溶栓治療,阿替普酶0.9 mg/kg,最大劑量控制在90 mg,靜脈注射10%,持續(xù)性靜脈泵入90%,于1 h內(nèi)泵完。溶栓后24 h給予阿司匹林(拜耳醫(yī)藥保健有限公司)100 mg/d口服,阿托伐他汀20 mg/次口服,依達拉奉右莰醇30 mg+生理鹽水100 ml靜脈滴注,均為2次/d。以溶栓后3個月的改良Rankin量表(modified Rankin scale,mRs)評分[8]作為近期預(yù)后的評估依據(jù),mRs評分≤2分判定為近期預(yù)后良好,mRs評分>2分判定為近期預(yù)后不良。隨訪1年,以ACI是否復(fù)發(fā)作為遠(yuǎn)期預(yù)后的評估標(biāo)準(zhǔn),復(fù)發(fā)的判定標(biāo)準(zhǔn)[9]:患者出現(xiàn)新的神經(jīng)功能缺損癥狀,經(jīng)頭顱MR、CT檢查證實出現(xiàn)新的腦梗死病灶。無復(fù)發(fā)判定為遠(yuǎn)期預(yù)后良好,復(fù)發(fā)判定為遠(yuǎn)期預(yù)后不良。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 外周血Keap1-Nrf2/ARE信號通路相關(guān)蛋白水平檢測:于溶栓前及溶栓后7 d、3個月抽取患者肘靜脈血5 ml ,采用免疫印跡法檢測Keap1、醌氧化還原酶1[NAD(P)H Quinone oxidoreductase 1,NQO1]、Nrf2、ARE蛋白相對表達量,試劑盒購自深圳市亞輝龍生物科技有限公司。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作,采用QuantityOne軟件測定灰度值,計算蛋白條帶灰度值與內(nèi)條帶灰度值比值,以此表示目的蛋白相對表達量。

1.4.2 病情程度評定:采用NIHSS評分[10],其內(nèi)容包括意識程度、回答問題的能力、遵從指令的能力、眼球運動、視野、面部肌力、上肢運動功能、下肢運動功能、肢體協(xié)調(diào)、感覺功能、語言、構(gòu)音、感覺忽視等。評分范圍為0～42分,分?jǐn)?shù)越高表示神經(jīng)受損越嚴(yán)重。

2 結(jié) 果

2.1 不同近期預(yù)后組溶栓前后外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白表達、NIHSS評分比較 2組溶栓后7 d、溶栓后3個月Keap1蛋白相對表達量、NIHSS評分低于溶栓前,NQO1、Nrf2、ARE蛋白相對表達量高于溶栓前(P<0.01);近期預(yù)后不良組溶栓后7 d、3個月Keap1蛋白相對表達量、NIHSS評分高于近期預(yù)后良好組,NQO1、Nrf2、ARE蛋白相對表達量低于近期預(yù)后良好組(P<0.01),見表1。

表1 不同近期預(yù)后組ACI患者溶栓前后外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白表達、NIHSS評分比較

2.2 不同遠(yuǎn)期預(yù)后組溶栓前后外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白表達、NIHSS評分變化比較 2組溶栓后7 d、溶栓后3個月Keap1蛋白相對表達量、NIHSS評分低于溶栓前,NQO1、Nrf2、ARE蛋白相對表達量高于溶栓前(P<0.01);遠(yuǎn)期預(yù)后不良組溶栓后7 d、3個月Keap1蛋白相對表達量、NIHSS評分高于遠(yuǎn)期預(yù)后良好組,NQO1、Nrf2、ARE蛋白相對表達量低于遠(yuǎn)期預(yù)后良好組(P<0.01),見表2。

表2 不同遠(yuǎn)期預(yù)后組ACI患者溶栓前后外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白表達、NIHSS評分比較

2.3 外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白與NIHSS評分的關(guān)系 ACI患者溶栓后7 d、3個月Keap1蛋白相對表達量與NIHSS評分呈正相關(guān)(P<0.01),NQO1、Nrf2、ARE蛋白相對表達量與NIHSS評分呈負(fù)相關(guān)(P<0.01),見表3。

表3 ACI患者NIHSS評分與外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白的關(guān)系 (r/P)

2.4 外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白對近遠(yuǎn)期預(yù)后的預(yù)測價值

2.4.1 近期預(yù)后的預(yù)測價值:繪制溶栓后7 d的外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白對ACI患者預(yù)測價值的ROC曲線,并計算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示,溶栓后7 d的 Keap1、NQO1、Nrf2、ARE蛋白及四者聯(lián)合預(yù)測近期預(yù)后不良的AUC為0.803、0.717、0.800、0.765、0.907,四者聯(lián)合優(yōu)于各蛋白單獨預(yù)測價值(Z/P=2.105/0.026、2.413/0.004、2.113/0.021、2.205/0.016),見表4、圖1。

圖1 外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白預(yù)測ACI患者近期預(yù)后的ROC曲線

表4 外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白對ACI患者近期預(yù)后的預(yù)測價值

2.4.2 遠(yuǎn)期預(yù)后的預(yù)測價值:繪制溶栓后3個月的外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白對ACI患者預(yù)測價值的ROC曲線,并計算AUC,結(jié)果顯示,溶栓后3個月的 Keap1、NQO1、Nrf2、ARE蛋白及四者聯(lián)合預(yù)測近期預(yù)后不良的AUC為0.766、0.765、0.812、0.767、0.927,四者聯(lián)合優(yōu)于各蛋白單獨預(yù)測價值(Z/P=2.238/0.010、2.241/0.008、2.115/0.019、2.231/0.012),見表5、圖2。溶栓后3個月的外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白預(yù)測遠(yuǎn)期預(yù)后的AUC與溶栓后7 d的外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白預(yù)測近期預(yù)后的AUC比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z/P=0.102/0.563)。

圖2 外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白預(yù)測ACI患者遠(yuǎn)期預(yù)后的ROC曲線

表5 外周血Keap1-Nrf2/ARE蛋白對ACI患者遠(yuǎn)期預(yù)后的預(yù)測價值

3 討 論

臨床普遍認(rèn)為,ACI發(fā)生發(fā)展機制較為復(fù)雜,其中公認(rèn)的是除了病程中腦局部缺氧缺血直接導(dǎo)致的神經(jīng)組織損害,還會在受損腦組織缺血再灌注基礎(chǔ)上致使氧化應(yīng)激反應(yīng)被激活、氧自由基過多釋放,造成腦細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化,從而形成微循環(huán)障礙、加劇腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞,成為間接造成神經(jīng)組織損害的主要原因之一[11-13]。因此,積極探索氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)信號通路在ACI患者中的變化成為臨床重要研究方向。

Keap1-Nrf2/ARE信號通路屬于機體內(nèi)重要的氧化應(yīng)激信號通路,其中Keap1、Nrf2是機體氧化/抗氧化狀態(tài)的重要調(diào)節(jié)中樞因子,ARE與Nrf2具有協(xié)調(diào)效應(yīng),參與氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生發(fā)展過程,NQO1是受Nrf2/ARE調(diào)控的抗氧化酶,能通過催化體內(nèi)多種代謝途徑達到抗氧化目的[14-15]。既往國內(nèi)外均有研究證實,Keap1-Nrf2/ARE信號通路可通過調(diào)控局部腦細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷在腦血管疾病中發(fā)揮重要作用[16-17]。田琴等[18]報道表明,缺血性腦卒中患者外周血Keap1-Nrf2/ARE信號通路呈異常表達狀態(tài),與神經(jīng)損傷密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),ACI患者溶栓后近期Keap1、NQO1、Nrf2、ARE蛋白相對表達量均與NIHSS評分密切相關(guān),可見外周血Keap1-Nrf2/ARE信號通路相關(guān)蛋白水平改變與ACI患者神經(jīng)功能缺損程度變化情況顯著相關(guān),是由于機體受到氧化應(yīng)激刺激會立即修飾Keap1半胱氨酸殘基,降低Nrf2穩(wěn)定性,導(dǎo)致Keap1與Nrf2發(fā)生解離,促使Nrf2結(jié)合細(xì)胞核內(nèi)的ARE,加快Nrf2/ARE之間的協(xié)調(diào)效應(yīng)活化進程,調(diào)控超氧化物歧化酶、NQO1等下游基因的表達,參與神經(jīng)功能損傷過程[19-21];在氧自由基大量釋放時會造成過多的Nrf2在細(xì)胞內(nèi)蓄積,逐漸向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位,識別ARE,啟動NQO1等多種抗氧化酶表達,發(fā)揮阻礙氧自由基生成作用,從而在ACI患者神經(jīng)組織損害發(fā)生及修復(fù)過程中產(chǎn)生相應(yīng)作用[22-23]。

同時,本研究發(fā)現(xiàn)ACI患者溶栓后近期Keap1蛋白相對表達量、NIHSS評分明顯降低,NQO1、Nrf2、ARE蛋白相對表達量明顯升高,其變化機制在于靜脈溶栓后ACI患者腦部微循環(huán)、神經(jīng)功能得到有效修復(fù),腦細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷有所減輕,促使Keap1-Nrf2/ARE信號通路相關(guān)蛋白水平隨之改善,這與該信號通路參與ACI氧化應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)功能損傷修復(fù)間接影響預(yù)后改善有關(guān)。此外,本研究創(chuàng)新性嘗試探討外周血Keap1-Nrf2/ARE信號通路相關(guān)蛋白對ACI患者近遠(yuǎn)期預(yù)后的預(yù)測價值,結(jié)果發(fā)現(xiàn),溶栓后7 d的Keap1、NQO1、Nrf2、ARE蛋白聯(lián)合預(yù)測近期預(yù)后的AUC最大,溶栓后3個月的Keap1、NQO1、Nrf2、ARE蛋白聯(lián)合預(yù)測遠(yuǎn)期預(yù)后不良的AUC最大,均優(yōu)于各蛋白單獨預(yù)測,提示臨床可通過檢測外周血Keap1-Nrf2/ARE信號通路相關(guān)蛋白水平變化有效預(yù)測ACI患者近遠(yuǎn)期預(yù)后情況,有利于及早采取針對性干預(yù)措施,降低預(yù)后不良風(fēng)險。不足之處:納入樣本量偏少,可能造成數(shù)據(jù)偏倚,且未對比外周血Keap1-Nrf2/ARE信號通路與常規(guī)影響因素預(yù)測預(yù)后價值的優(yōu)劣,今后需收集更多病例,做進一步探究與分析,以獲取更可靠的數(shù)據(jù)支持。

綜上可知,ACI患者外周血Keap1-Nrf2/ARE信號通路變化與近遠(yuǎn)期預(yù)后顯著相關(guān),可作為有效預(yù)測近遠(yuǎn)期預(yù)后情況的重要輔助途徑,能為臨床制定改善預(yù)后方案提供可靠的參考依據(jù)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

張歡:設(shè)計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;祝善堯:提出研究思路,分析試驗數(shù)據(jù),論文審核;葛偉、洪斌:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;劉爽:進行統(tǒng)計學(xué)分析