mTORC1-TFEB信號通路對肝臟缺血再灌注損傷模型大鼠肝細胞線粒體結構和肝功能的影響*

唐天豪, 張瑩**, 呂宗偉, 胡玉香, 黃平, 張玉, 潘寧波

(1.貴州省人民醫院 肝膽外科, 貴州 貴陽 550002; 2.貴州省人民醫院 病理科, 貴州 貴陽 550002; 3.貴州省人民醫院 信息科, 貴州 貴陽 550002; 4.廣元市第一人名醫院 胃腸外科, 四川 廣元 628040)

肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperdusion injury,HIRI)是肝臟在遭受嚴重的缺血缺氧打擊后導致肝功能恢復遲緩的并發癥,是臨床工作中亟待解決的問題。線粒體的結構功能損傷是HIRI的核心問題,而逆轉線粒體損傷可有效減輕HIRI［1-3］。轉錄因子EB(transcription factor EB,TFEB)是一種能夠調節細胞代謝、自噬和溶酶體等細胞活動的特殊蛋白,其轉錄活性受雷帕霉素靶蛋白復合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)介導的磷酸化機制調控,特異性抑制mTORC1作用的靶點,可減少TFEB磷酸化的發生、從而促進其轉錄活性［4-5］。近期研究發現,TFEB信號通路在急性腎損傷［6］、心肌［7］和腦［8］缺血再灌注損傷中均具有保護作用,同時TFEB還在細胞內通過維持線粒體自噬和生物發生之間的平衡以調控線粒體變化［9］,而此通路在HIRI中研究甚少,本研究初步分析mTORC1-TFEB信號通路在HIRI中對線粒體的影響及意義,以期為HIRI防治提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 36只雄性無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級Sprague Dawley(SD)大鼠,體質量(240±10)g,購自遼寧長生生物技術股份有限公司,合格證號SCXK(遼)-2020-0001,研究獲貴州中醫藥大學倫理委員會批準(編號20210094);大鼠自由飲食飲水,適應性喂養7 d。

1.1.2主要試劑及儀器 谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)試劑盒、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,磷酸化mTORC1(p-mTORC1)一抗購自美國Cell Signaling Technology公司,TFEB一抗購自武漢三鷹生物技術有限公司,3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體購自北京索萊寶科技有限公司。引物設計合成購自上海生工生物工程股份有限公司,RNA提取試劑盒購自北京天漠科技開發有限公司,SYBRTM Green PCR試劑盒和High Capacity cDNA 反轉錄試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司。CFX96熒光定量PCR儀、C1000 Thermal Cycler、ChemiDocTMTouch Imaging System凝膠成像分析系統來自美國Bio-Rad公司,JEM-1400PLUS透射電子顯微鏡來自日本JEOL公司,UCT-RT超薄切片機來自德國Leica公司,Multiskan GO 1510酶標儀來自美國Thermo Fisher Scientific公司,1580R型高速低溫冷凍離心機來自丹麥Labogene公司,多功能電泳系統來自美國Hoefer公司。

1.2 動物分組及造模

36只SD雄性大鼠,隨機均分為對照組、模型組及藥物組,對照組和模型組大鼠術前持續3 d腹腔注射0.9%NaCl溶液(2.0 mL/kg·d),藥物組大鼠術前持續3 d腹腔注射雷帕霉素溶液(2.0 mL/kg·d);各組大鼠禁食1 d后,2%戊巴比妥鈉腔內注射麻醉,取腹部正中切口,逐層進入腹腔并解剖出第一肝門,模型組和藥物組大鼠以無創血管夾夾閉第一肝門、使肝臟完全缺血30 min后取出血管夾,對照組大鼠不夾閉第一肝門,各組大鼠間斷縫合關閉腹腔、置于清潔干燥鼠籠待蘇醒。分別于術后24 h、72 h兩個時間點每組隨機取6只大鼠肝臟組織用于后續實驗。

1.3 觀察指標

1.3.1肝組織形態學特征 取固定在10%中性福爾馬林的肝臟組織,常規制成石蠟切片、HE染色,于400倍光學顯微鏡下觀察大鼠肝臟組織學特征,參照組織學活性指數［10］對肝臟組織結果進行計分,計分項包括壞死性炎癥計分、結構改變、纖維化和肝硬化。

1.3.2透射電鏡觀察肝細胞線粒體超微結構 取大鼠肝臟組織切成約1 mm3的組織塊,固定于1%餓酸中,梯度乙醇脫水、環氧樹脂包埋后超薄切片、枸椽酸鉛及醋酸鈾雙重染色后,嵌入環氧樹脂,于8 000倍透射電鏡下觀察肝細胞內線粒體超微結構變化。

1.3.3檢測AST及ALT 取部分肝臟組織,按照重量∶體積(g∶mL)=1∶9的比例加入PBS液,充分研磨勻漿、離心,取上清液按照比色法說明書測定谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)濃度。

1.3.4蛋白印跡實驗(Western Blot)檢測肝臟組織p-mTORC1、TFEB蛋白的表達 取肝臟組織100 mg研磨、裂解、勻漿后測定蛋白濃度;制備電泳上樣樣品,取50 μg蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白、轉膜、封閉,加入一抗p-mTORC1(1∶1 000)、TFEB(1∶1 000)孵育過夜,洗凈后加入二抗孵育,再次洗凈后采用增強化學發光法顯色,通過Image lab 5.0凝膠成像系統軟件分析目標帶的灰度值。

1.3.5實時熒光PCR(RT-PCR)檢測肝臟組織p-mTORC1、TFEB mRNA表達 取肝臟組織30 mg提取總mRNA,測定總濃度,使用反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA。以cDNA產物作為模板,配置反應體系:qPCR預混液10 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、cDNA 1 μL、滅菌水7.0 μL。PCR擴增模式:94 ℃ 10 min,(94 ℃ 20 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s)40個循環,以GAPDH蛋白為參照,利用2-ΔΔCT分析相關基因轉錄情況。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 肝組織形態學特征

術后24 h,對照組大鼠肝臟組織形態表現正常、結構完整,組織學活性指數總計分為0分;模型組大鼠肝臟組織中央靜脈明顯充血,肝小葉結構異常紊亂,肝細胞出現大量水腫、空泡樣變性甚至壞死,組織學活性指數總計分顯著升高;藥物組肝臟組織細胞損傷程度較模型組輕,且組織學活性指數總計分較模型組降低(P<0.05)。術后72 h,對照組較術后24 h無明顯變化,組織學活性指數總計分無變化(P>0.05);模型組及藥物組肝臟損傷程度相對同組術后24 h減輕(P<0.05),組織學活性指數總計分較模型組均降低,且藥物組減輕程度明顯優于模型組(P<0.05)。見表2和圖1。

圖1 術后24及72 h時各組大鼠肝臟組織學(HE,×400)

表2 術后24 及72 h時各組大鼠肝臟組織學活性指數

2.2 肝細胞線粒體超微結構

術后24 h,對照組大鼠肝細胞內線粒體形態正常,大小居中,多呈圓或橢圓形狀,內部嵴飽滿,膜結構完整;模型組大鼠肝細胞內線粒體腫脹變形甚至破裂,內部嵴斷裂嚴重,內外雙層膜結構破損;藥物組大鼠肝細胞內線粒體損傷程度較模型組明顯減輕。術后72 h,對照組大鼠肝細胞相對術后24 h無明顯變化;模型組及藥物組大鼠肝細胞內線粒體破壞程度相對同組術后24 h時減輕,且藥物組線粒體損傷減輕程度明顯優于模型組。見圖2。

注：紅色箭頭所示形態正常的線粒體,黃色箭頭所示結構受損嚴重的線粒體,綠色箭頭所示結構受損較輕的線粒體,藍色箭頭所示內質網。

2.3 肝臟組織AST、ALT水平

術后24 h,與對照組相比,模型組及藥物組大鼠肝臟的AST、ALT表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,藥物組大鼠肝臟的AST、ALT表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.05)。術后72 h,與對照組相比,模型組及藥物組大鼠肝臟AST、ALT表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,藥物組大鼠肝臟AST、ALT表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.05)。與同組術后24 h比較,術后72 h模型組及藥物組大鼠肝臟AST、ALT表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 術后24 及72 h時各組大鼠肝臟組織AST及ALT水平

2.4 肝臟組織p-mTORC1、TFEB蛋白的表達

術后24 h,與對照組相比,模型組及藥物組大鼠肝臟組織p-mTORC1蛋白表達水平降低而TFEB 蛋白表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,藥物組大鼠肝臟的p-mTORC1 蛋白表達水平降低而TFEB蛋白表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.05)。術后72 h,與對照組相比,模型組及藥物組大鼠肝臟的p-mTORC1蛋白表達水平降低而TFEB蛋白表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,藥物組大鼠肝臟p-mTORC1 蛋白表達水平降低而TFEB蛋白表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.05)。與同組術后24 h比較,術后72 h模型組及藥物組大鼠肝臟p-mTORC1蛋白表達水平升高而TFEB蛋白表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4和圖3。

圖3 術后24及72 h時各組大鼠肝臟組織p-mTORC1和TFEB蛋白表達

表4 術后24及72 h時各組大鼠肝臟組織p-mTORC1、TFEB蛋白表達

2.5 肝臟組織p-mTORC1、TFEB mRNA表達

術后24 h,與對照組相比,模型組及藥物組大鼠肝臟p-mTORC1 mRNA表達水平降低、TFEB mRNA表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,藥物組大鼠肝臟p-mTORC1 mRNA表達水平降低、TFEB mRNA表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.05)。術后72 h,與對照組相比,模型組及藥物組大鼠肝臟p-mTORC1 mRNA表達水平降低、TFEB mRNA表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,藥物組大鼠肝臟p-mTORC1 mRNA表達水平降低、TFEB mRNA表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.05)。與同組術后24 h比較,術后72 h模型組及藥物組大鼠肝臟p-mTORC1 mRNA表達水平升高、TFEB mRNA表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 術后24及72 h時各組大鼠肝臟組織p-mTORC1、TFEB mRNA表達

3 討論

HIRI是指肝臟血供在一定時間內被完全中斷,血流急速恢復供應后肝功能卻不能及時恢復,甚至會繼續增加肝臟結構和功能的破壞程度,進一步誘發多種肝臟并發癥。HIRI常發生于腫瘤切除術、肝臟移植術以及重度休克等治療期間,嚴重影響患者術后恢復質量。而HIRI發生機制仍不明確,相關研究發現可能與氧化應激反應、線粒體結構功能受損、細胞程序性死亡以及炎癥反應等相關［11-13］,其中線粒體結構功能的變化在HIRI中更為舉足輕重［14］。

肝臟是人體內能量代謝的中樞,是各種生命活動代謝的重要場所,其細胞內富含大量的線粒體,能夠為細胞生命活動提供足夠的能量補給,因此肝臟線粒體結構功能改變在HIRI中的作用成為近期研究熱點［15-17］,同時相關實驗也發現在HIRI中肝臟損傷的程度與線粒體損傷程度呈正相關［18］,抑制線粒體損傷、促進線粒體恢復有助于降低HIRI。TFEB作為人類小眼畸形相關轉錄因子(microphthalmia-associated transcription factor,MITF)家族中的一員,在參與調節自噬和溶酶體生物發生的同時,TFEB也在調控細胞內線粒體穩態中發揮著尤其重要的作用［19］。因此有理由推測mTORC1-TFEB信號通路在HIRI中對線粒體有一定影響作用,可通過改善線粒體損傷減輕HIRI。

mTORC1是一組對雷帕霉素敏感的特殊蛋白,主要由Raptor、mLST8和mTOR結合而成,能密切調控細胞生長發育、細胞自噬以及能量代謝［20］,其磷酸化機制作用Ser211調控TFEB的亞細胞定位和活性,可導致磷酸化狀態的TFEB與細胞質伴侶的酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-單加氧酶活化蛋白(tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein,YWHAZ/14-3-3)結合后停留在細胞質中失去生物活性;而抑制mTORC1的活性后可促進TFEB發生去磷酸化進行核轉移,與細胞核內調控原件結合參與細胞多個生物反應［9,21］。自噬是將被標記的細胞質相關成分送至溶酶體進行生物降解和成分回收利用的一種細胞內穩態機制,可大致分為巨自噬、微自噬以及伴侶自噬［22］,而線粒體自噬作為微自噬中的一種形式,以被標記的受損線粒體為主要目標進行識別、融合及降解,對于維持線粒體質量尤其重要［23］。當線粒體在細胞內遭受嚴重打擊時,內膜發生變化通透性增加,啟動經典的PINK1/Parkin線粒體自噬途徑來清除受損嚴重的線粒體。TFEB作為自噬通路的關鍵因子,可以通過上調自噬通路相關蛋白的表達水平參與線粒體自噬,從而吞噬受損的線粒體［6］,并且TFEB的過表達還可以減少線粒體損傷進一步累積,達到減輕線粒體損傷的目的［24］。因此在本研究中,再灌注早期(24 h)時,模型組TFEB正常活化過程受阻,導致線粒體損傷累積過重無法被及時清除,在電鏡下觀察到的線粒體腫脹破壞嚴重,形態結構不復存在,殘存的正常線粒體為數不多,肝臟組織破壞嚴重且肝功能明顯受損;藥物組在特異性抑制劑雷帕霉素的預處理下,p-mTORC1蛋白和mRNA的表達較模型組明顯降低,而TFEB蛋白和mRNA的表達較模型組顯著升高,TFEB過表達后啟動生物反應,損傷嚴重的線粒體能夠及時被清除,因此電鏡下觀察到的線粒體破壞程度較模型組顯著減輕,尚未完全損壞,膜結構相對完整,而且肝臟組織結構、功能損傷程度明顯減輕,肝細胞變性、壞死以及肝組織中AST、ALT表達水平較模型組明顯下降。TFEB不僅通過上調自噬活性減輕線粒體損傷的積累,同時還可以誘導線粒體生物發生,從而減輕線粒體損傷并促進線粒體恢復［25］。再灌注晚期(72 h)時,藥物組TFEB的相關表達仍處于一個高水平狀態,線粒體形態恢復效果明顯優于模型組,AST、ALT表達水平下降明顯,肝臟恢復程度也明顯優于模型組,提示促進線粒體恢復,可降低HIRI,促進肝功能恢復。

綜上所述,mTORC1-TFEB信號通路激活后通過減輕線粒體損傷、促進線粒體恢復,從而改善肝功能、降低肝臟缺血再灌注損傷程度。