湖北隨州地區(qū)孕婦2772例β-地中海貧血基因型分布及血常規(guī)參數(shù)變異調(diào)查研究

劉 平,黃宏耀

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院,遼寧 錦州 121001;2.隨州市中心醫(yī)院檢驗科,湖北 隨州 441300)

地中海貧血是一組以一個或多個珠蛋白鏈合成減少或缺乏為特征的遺傳性溶血疾病,以α-地中海貧血和β-地中海貧血最多見[1]。β-地中海貧血是由于β珠蛋白基因功能缺失或降低,引起α、β珠蛋白肽鏈不平衡所致[2-3]。對育齡人群進行婚前篩查和產(chǎn)前診斷是目前減少重癥患兒出生的有效措施。作為一種常見遺傳病,β-地中海貧血在不同地區(qū)的分布差異較大,在我國長江以南地區(qū)發(fā)病率較高[4]。一項基于中國大陸16項研究的薈萃分析[5]顯示,湖北地區(qū)β-地中海貧血的患病率為0.01%～1.59%。既往研究[6-7]發(fā)現(xiàn),β-地中海貧血基因發(fā)病率及突變型即使在同一省份不同地區(qū)之間亦不盡相同。回顧文獻發(fā)現(xiàn),目前仍缺乏湖北隨州地區(qū)孕婦β-地中海貧血患病率及突變譜的支持性資料。本研究旨在了解湖北隨州地區(qū)孕婦β-地中海貧血基因攜帶率和突變類型,并探討其與血液學(xué)參數(shù)的關(guān)系,以期為本地區(qū)β-地中海貧血的產(chǎn)前篩查、診斷及出生缺陷預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2021年1月至2022年7月于隨州市中心醫(yī)院產(chǎn)檢并進行地中海貧血篩查的孕婦2772例為研究對象,其中年齡21～34歲,平均(27.71±5.10)歲;孕周9～14周,平均(12.58±2.63)周。納入標準:年齡20～35歲;超聲均提示活胎;均接受地中海貧血血液學(xué)表型篩查和地中海貧血基因診斷;受檢者知情同意并簽署知情同意書。排除標準:患有其他血液系統(tǒng)疾病者;僅接受地中海貧血血液學(xué)表型篩查和地中海貧血基因診斷檢測之一者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集:所有孕婦均采集外周靜脈血2 ml/管置于真空乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中,共采集3管,4 ℃保存3 d以內(nèi)。

1.2.2 血液學(xué)表型分析

1.2.2.1 血常規(guī)檢測:采用全自動血液分析儀(日本SYSMEX公司)檢測紅細胞分布寬度(RDW)、血紅蛋白(Hb)、平均紅細胞體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH),將MCV<82 fl和(或)MCH<27 pg的孕婦視為地中海貧血初篩陽性者。

1.2.2.2 Hb電泳分析:對地中海貧血初篩陽性孕婦采用Capillary2全自動毛細管電泳儀(法國SEBIA公司)及配套試劑對采集的血液標本進行Hb電泳分析,將血紅蛋白A2(HbA2)>3.5%或血紅蛋白F(HbF)>2.5%或出現(xiàn)異常血紅蛋白E(HbE)帶者視為β-地中海貧血血液學(xué)表型陽性,并進一步行β-地中海貧血基因檢測。

1.2.3 地中海貧血基因檢測

1.2.3.1 DNA提取:取200 μl EDTA抗凝血標本,采用基因組DNA提取試劑盒(批號:200917,潮州凱普生物化學(xué)有限公司)提取基因組DNA,取其中5 μl抽提好的DNA樣本用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增,其余-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 PCR擴增:從β-地中海貧血基因檢測試劑盒(批號:2010509,廣州凱普醫(yī)藥科技有限公司)中取出PCR混合液。8000 r/min離心1 min后,取445 μl的PCR混合液和5 μl地中海貧血DNA聚合酶充分混勻配制擴增試劑。8000 r/min離心1 min后,將擴增試劑以45 μl/管加入到PCR反應(yīng)管中,然后加入5 μl DNA樣本。8000 r/min離心1 min后,采用定性PCR儀(杭州博日科技股份有限公司)進行擴增反應(yīng)。擴增條件:95 ℃預(yù)變性15 min,97 ℃ 50 s、60 ℃ 60 s、72 ℃ 120 s共35個循環(huán),72 ℃再延伸10 min。

1.2.3.3 雜交與顯色:將PCR擴增產(chǎn)物95 ℃變性5～10 min后,置于冰水浴中不少于2 min,然后與已預(yù)熱至42 ℃的雜交液混勻,于核酸分子雜交儀(廣東凱普生物科技股份有限公司)進行導(dǎo)流雜交,最后按說明書步驟對雜交膜進行顯色后判定結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 2772例孕婦地中海貧血初篩情況 2772例接受地中海貧血篩查的孕婦中,經(jīng)血常規(guī)參數(shù)分析,初篩陽性362例(13.06%)。進一步Hb電泳分析發(fā)現(xiàn),β-地中海貧血血液學(xué)表型陽性91例(3.28%),其中HbA2>3.5%的孕婦86例,HbF>2.5%的孕婦3例,出現(xiàn)異常HbE條帶者2例。

2.2 β-地中海貧血基因檢測結(jié)果 對β-地中海貧血血液學(xué)表型陽性的孕婦均進行β-地中海貧血基因檢測,檢出β-地中海貧血基因突變82例,均為單基因異常,其中β+突變37例(45.12%),β0突變45例(54.88%),具體基因型分布及構(gòu)成比情況見表1、2。

表1 隨州地區(qū)β-地中海貧血β+基因突變情況[例(%)]

表2 隨州地區(qū)β-地中海貧血β0基因突變情況[例(%)]

2.3 β-地中海貧血基因組與非地中海貧血組血常規(guī)參數(shù)比較 見表3。將82例檢出β-地中海貧血基因突變的孕婦納入β-地中海貧血組,并按1∶1比例隨機選取非地中海貧血孕婦納入非地中海貧血組。β-地中海貧血組RDW≥15%、Hb<110 g/L、MCV<82 fl、MCH<27 pg以及MCV<82 fl和(或)MCH<27 pg的孕婦比例顯著高于非地中海貧血組(均P<0.05)。

表3 β-地中海貧血組與非地中海貧血組血常規(guī)參數(shù)比較[例(%)]

2.4 β+突變和β0突變孕婦血常規(guī)參數(shù)比較 見表4。對不同β-地中海貧血基因突變類型孕婦的血常規(guī)參數(shù)比較發(fā)現(xiàn),β+突變組RDW顯著低于β0突變組,而Hb、MCV和MCH顯著高于β0突變組(均P<0.05)。

表4 β+突變和β0突變孕婦血常規(guī)參數(shù)比較

3 討 論

β-地中海貧血是我國南方地區(qū)的高發(fā)遺傳性溶血性疾病,尤以廣東、廣西、海南等省份高發(fā)[8-10]。β-地中海貧血根據(jù)突變后β珠蛋白的基因功能可分為β0突變(完全缺失)和β+突變(部分缺失)。對育齡期人群和孕婦進行普篩及基因檢測以確定高風(fēng)險個體,并通過產(chǎn)前診斷減少重癥患兒的出生已被證實是β-地中海貧血行之有效的預(yù)防手段。因此,了解本地區(qū)β-地中海貧血基因的攜帶率及突變譜有助于地區(qū)醫(yī)院更精準地防控β-地中海貧血。本研究中2772例接受地中海貧血篩查的孕婦中,共檢出β-地中海貧血基因攜帶者82例,攜帶率為2.96%,與既往報道中湖北省部分地區(qū)如武漢[11]、荊州[6]、宜昌[7]以及黃石[12]等地的β-地中海貧血基因攜帶率的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果大致相符合。

本研究中共檢出9種常見的β-地中海貧血基因型,其中占比最高的前3種基因型分別是IVS-Ⅱ-654(36.59%)、CD41-42(23.17%)和CD17(18.29%)。和本研究結(jié)果相一致的是,有研究者調(diào)查了湖北省武漢市新生兒中β-地中海貧血基因型的流行情況,其中最常見的3種β-地中海貧血基因型分別是IVS-Ⅱ-654、CD41-42和CD17[13]。另有研究[14]發(fā)現(xiàn),湖北東、中、西部地區(qū)不同β-地中海貧血基因型比例并不一致,與湖北東、西部不同,中部地區(qū)CD-17突變型在所有β-地中海貧血基因型中排名第二。這可能與湖北省流動人口分布不平衡有關(guān),湖北中部地區(qū)流動人口明顯多于東西部地區(qū),而流動人口是造成地中海貧血流行的重要因素之一。

本研究中,與非地中海貧血孕婦相比,攜帶β-地中海貧血基因的孕婦MCV和MCH均較低,進一步證實MCV和MCH值在β-地中海貧血的第一步篩查中是可靠的。有研究者建議將MCV和MCH作為α-和β-地中海貧血篩查第一步的重要指標[15]。但也有研究[14]顯示,在α-地中海貧血基因攜帶者中,MCV和MCH降低的孕婦中比例分別為34.73%和35.88%。正如一項研究[16]所報道的,大多數(shù)α-地中海貧血靜止型攜帶者的血液學(xué)特征表現(xiàn)為正常。因此,利用MCV和MCH初步篩查懷孕的α-地中海貧血攜帶者是不合適的。這些結(jié)果可為圍產(chǎn)期保健中的地中海貧血篩查提供重要參考。

β-地中海貧血所致的貧血程度或輕或重,其除了與異常基因數(shù)目有關(guān)外,還與異常基因類型有關(guān)[17-18]。一般認為β+突變所致的疾病程度相對輕,而β0突變所致的疾病程度相對較重,前者β珠蛋白肽鏈的合成部分被抑制,即β鏈能合成,但合成減少;而后者的β珠蛋白肽鏈合成完全被抑制,即β鏈完全不能合成[19-20]。我國常見的β+突變包括IVS-Ⅱ-654、-28、βE、-29、-30、-32、CAP、IVS-Ⅰ-5,而β0突變包括CD41-42、CD17、CD71-72、Int、CD31、CD14-15、IVS-Ⅰ-1、CD43、CD27-28等。既往研究[21]發(fā)現(xiàn),成人β0突變所致的地中海貧血較β+突變所致的地中海貧血程度加重,血液學(xué)表型更嚴重。本研究結(jié)果顯示,β+突變組的RDW顯著低于β0突變組,而Hb、MCV和MCH顯著高于β0突變組,提示β0突變型的貧血程度更甚,血液學(xué)表型更嚴重,與研究[21]結(jié)果相符合。

綜上所述,湖北隨州地區(qū)孕婦β-地中海貧血基因型復(fù)雜多樣,以IVS-Ⅱ-654和CD41-42突變?yōu)橹?且不同基因型的血液學(xué)參數(shù)具有顯著差異,聯(lián)合血液學(xué)篩查具有一定的經(jīng)濟效益。另外,本研究也存在一定局限性:由于檢測方法的局限性,本研究中只檢測了中國人17個常見的β-地中海貧血基因突變,而其他罕見的突變并沒有被檢測;本研究中未調(diào)查不同民族間地中海貧血攜帶者的流行情況。