肝癌組織角蛋白23表達與患者臨床病理特征及預后關系研究

董 勇,程 序,梁 晗,華 靜,譚莉霞,王航宇,閆春曉,魏書堂

(河南大學第一附屬醫院消化內科,河南 開封 475100)

原發性肝癌作為惡性腫瘤,其發病率在全世界腫瘤中排第5位[1]。中國是肝癌高發地區,臨床發病率有持續上升趨勢。目前盡管肝癌的治療措施已取得顯著進步,但患者3年生存期仍未獲得顯著延長[2]。肝癌的發展是多因素造成的結果。因此,尋找參與肝癌發生、發展的生物分子標志物在臨床上有重要意義。角蛋白屬于中間絲蛋白家族成員,大量表達于上皮細胞,且與細胞分化密切相關[3]。杭群等[4]研究顯示,角蛋白23(Keratin 23,KRT23)在胃癌患者癌組織中高表達,其表達水平與淋巴結轉移、TNM分期緊密相關。KRT23是一種應激誘導蛋白,其表達水平與肝病的嚴重程度相關[5]。但目前KRT23在肝癌中的作用研究尚不清楚。因此,本研究探討肝癌患者癌組織中KRT23表達變化,并分析其與肝癌患者臨床病理特征及預后的關系,期望為評估肝癌預后提供有價值的參考依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2018年1月至2019年6月就診于河南大學第一附屬醫院并接受手術治療的肝癌患者86例,其中男性48例,女性38例;年齡38～80歲,平均(60.24±10.84)歲。病例納入標準:符合《原發性肝癌的臨床診斷與分期標準》[6]中的病理診斷標準;術前未進行全身化療、放療;簽署知情同意書。排除標準:腎功能障礙;合并急慢性炎癥疾病、免疫系統疾病;患其他惡性腫瘤、全身感染性疾病。本研究已通過醫院倫理委員會審批。

1.2 標本收集 收集所有患者的肝癌組織及癌旁正常組織(距離癌組織5 cm以上),一份迅速置于液氮冷凍后備用,另一份制作成石蠟標本。收集的肝癌組織及癌旁組織均經病理檢查證實。

1.3 免疫組織化學法檢測KRT23表達水平 將肝癌組織和癌旁正常組織的石蠟標本進行切片(厚度約3 μm)、烘干。將切片進行脫蠟,用枸櫞酸鈉抗原修復液進行抗原修復。采用3% H2O2阻斷浸泡5 min,再沖洗。將KRT23單克隆抗體(貨號:ab156569,Abcam公司)滴加于組織上,4 ℃冰箱過夜。應用二抗(貨號:ab6721,Abcam公司)室溫孵育1 h,PBS液沖洗。DAB顯色5 min,蘇木素復染2 min,再分化、返藍、脫水、封片,于顯微鏡下觀察切片。由2名以上高年資病理醫師獨立讀片評定,結果不一致時共同商議。每例標本隨機計數5個視野(200倍),計數視野中陽性細胞所占百分比,染色強度標準參照文獻[7]。

1.4 蛋白免疫印跡檢測KRT23蛋白水平 提取組織中總蛋白,用BCA蛋白定量試劑盒(貨號:AWB0104b,長沙艾碧維生物科技有限公司)對總蛋白進行定量分析。取50 μg總蛋白用SDS-PAGE進行電泳以分離蛋白,然后進行濕法轉膜至PVDF膜上,在5% BSA中封閉1 h,加入兔抗人KRT23(貨號:ab156569,Abcam公司)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(貨號:ab181602,Abcam公司,稀釋比例1∶1000)4 ℃過夜,再加入二抗(貨號:ab6721,Abcam公司,稀釋比例1∶500)37 ℃孵育1 h,ECL顯色后觀察。以GAPDH為內參,計算肝癌組織或癌旁組織中KRT23蛋白相對表達水平。

1.5 術后隨訪 收集肝癌患者術后隨訪門診記錄或復查記錄,最長隨訪時間為3年,隨訪至2022年6月,記錄患者生存時間。總生存期為開始治療至死亡或失訪的時間。

2 結 果

2.1 肝癌組織與癌旁正常組織KRT23相對表達水平比較 蛋白免疫印跡結果顯示,癌旁正常組織KRT23相對表達水平為1.03±0.13,肝癌組織KRT23相對表達水平為1.36±0.18,后者高于前者(t=13.783,P<0.05)。免疫組織化學檢測結果(圖1)顯示,肝癌組織及癌旁正常組織KRT23陽性表達率分別為80.23%(69/86)和29.07%(25/86),前者高于后者(χ2=45.416,P<0.05)。

圖1 肝癌組織KRT23陰性(左)

2.2 KRT23表達水平與患者臨床病理特征的關系 見表1。86例患者中,TNM分期(美國腫瘤聯合委員會AJCC 2018)Ⅰ-Ⅱ期34例,Ⅲ期52例;甲胎蛋白(AFP)<400 μg/L 54例,≥400 μg/L 32例;乙肝表面抗原(HBsAg)陽性66例,陰性20例;Child-Pugh分級中,A級76例,B級10例。分析結果顯示,Ⅲ期肝癌患者肝癌組織KRT23陽性表達水平顯著高于Ⅰ-Ⅱ期肝癌患者(P<0.05)。

表1 KRT23表達與肝癌患者臨床病理特征的關系[例(%)]

2.3 影響肝癌患者預后的危險因素分析 見表2。以肝癌患者3年預后為因變量(預后良好=0,預后不良=1),將年齡(<60歲=0,≥60歲=1)、性別(女=0,男=1)、AFP(<400 μg/L=0,≥400 μg/L=1)、TNM分期(Ⅰ-Ⅱ期=0,Ⅲ期=1)、乙肝表面抗原(陰性=0,陽性=1)、Child-Pugh分級(A級=0,B級=1)、KRT23表達水平(陰性=0,陽性=1)作為自變量進行Cox回歸分析。單因素Cox回歸分析表明,TNM分期、KRT23均是影響肝癌患者預后不良的危險因素(均P<0.05)。多因素Cox回歸分析表明,TNM分期Ⅲ期、KRT23陽性是肝癌患者預后不良的獨立危險因素(均P<0.05)。

表2 影響肝癌患者預后危險因素Cox回歸分析

2.4 肝癌組織中KRT23表達與預后的關系 見圖2。KRT23陰性患者3年累積生存率為64.70%,KRT23陽性患者3年累積生存率為29.00%,后者低于前者(Log-Rank χ2=6.899,P=0.009)。

圖2 肝癌患者3年隨訪期間Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

肝癌是我國常見腫瘤[8]。目前,手術切除是延長肝癌患者生存期的有效辦法,但大部分肝癌患者確診時已處于中晚期,能夠手術治療者不到15%[9]。臨床研究[10-11]發現,肝癌患者術后復發率也較高,預后較差。因此,深入探究肝癌的發生、發展機制具有重要的臨床意義。

中間絲蛋白家族是細胞骨架的重要組成部分,由中間絲蛋白組成的細胞骨架支撐整個細胞。中間絲蛋白家族有5種主要類型,Ⅰ-Ⅳ型是構成細胞質的蛋白,Ⅴ型是構成細胞核骨架的蛋白[12]。角蛋白是中間絲蛋白家族主要的成員,包含Ⅰ和Ⅱ型[13]。角蛋白是中間鏈接蛋白與微絲蛋白,均表達于上皮細胞中。在機體細胞發生異常凋亡時,角蛋白表現出高度活性。角蛋白可直接參與細胞有絲分裂、分化及凋亡等過程,可調節細胞形態、運動力、蛋白質合成及膜運輸過程[14]。角蛋白侵襲能力強,在癌癥的侵襲和轉移中具有關鍵作用。有研究[14-15]證實,肝癌組織中角蛋白19、角蛋白7表達高的患者預后更差,且角蛋白磷酸化后引起結構重塑,可增強肝癌細胞的侵襲能力。肝癌細胞體內存在侵襲和轉移[16]。

研究[17]顯示,角蛋白在細胞膜屏障功能中起重要作用。據報道,角蛋白的異常表達與癌細胞的侵襲和遷移有關[18]。KRT23是角蛋白基因家族中一個新的Ⅰ型成員。研究[19]證實,KRT23通過TGF-β/Smad信號通路調控上皮間質轉化,進而調節卵巢癌細胞遷移,體外實驗表明KRT23的敲低抑制了卵巢癌細胞遷移和侵襲。Kim等[20]研究證實,過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARA)是一種配體激活的轉錄因子和脂質代謝的關鍵介質,慢性PPARA激活會導致小鼠的肝細胞增殖、肝腫大,并最終導致肝細胞癌,PPARA激活提高了瘤細胞病毒癌基因(MYC)表達,MYC又增強了參與癌細胞增殖的相關基因KRT23的表達。研究[21]報道,在KRT23受到組蛋白脫乙酰化酶抑制劑誘導轉錄增加的過程中,細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p2lWAF1/CIPI起到關鍵的調節作用,證明KRT23參與細胞分化。研究[22]顯示,KRT23過表達上調了結腸癌細胞中端粒酶逆轉錄酶(hTERT)活性及hTERT啟動子驅動的熒光素酶和端粒酶活性的升高,而結腸癌細胞中KRT23的敲低抑制了與細胞周期和DNA修復相關的關鍵分子的表達,從而阻止了結腸癌細胞的增殖。本研究蛋白免疫印跡檢測結果顯示,肝癌組織中KRT23相對表達水平明顯高于癌旁正常組織,提示KRT23可能影響肝癌的發生。

本研究顯示,肝癌組織中KRT23陽性表達率顯著高于癌旁正常組織,且Ⅲ期肝癌患者肝癌組織中KRT23表達水平顯著高于Ⅰ-Ⅱ期肝癌患者,提示KRT23參與肝癌的發生與發展。角蛋白影響腫瘤的侵襲、轉移過程,腫瘤組織中存在角蛋白裂解片段或全長片段,提示癌癥患者存在較差預后[18]。本研究預后分析顯示,KRT23陰性患者3年累積生存率高于KRT23陽性患者,提示KRT23可能影響肝癌患者預后,表明KRT23陽性可能對肝癌患者預后不良的預測有貢獻。本研究還發現,KRT23陽性是肝癌患者預后不良的獨立危險因素。

綜上所述,肝癌組織KRT23呈高表達,且與肝癌患者預后不良有關,有望成為預測肝癌患者預后不良的生物學指標。