結腸癌患者血清微小RNA-193a-5p和微小RNA-139-5p表達檢測及其對預后的影響

余 亮,郭 建,周國強,石志良,俞 鋮,周 放

(徐州醫科大學附屬常熟醫院胃腸外科,江蘇 常熟 215500)

結腸癌指結腸黏膜上皮在環境或遺傳等多種致癌因素作用下發生的惡性病變[1]。高發年齡主要集中在40～50歲,占所有惡性腫瘤的10%～15%。近年來結腸癌的發病率在我國明顯呈上升趨勢[2],有50%結腸癌來自于結腸病變,在病理檢查過程中常?？梢砸姷皆錾约跋倭龊桶┳兏鱾€階段的影像。結腸癌目前發病機制尚不明確,通常認為是多種高危因素共同作用的結果,飲食中過多地攝入脂肪和蛋白、缺乏新鮮蔬菜和纖維素類食品以及缺乏適度運動會增加患結腸癌的概率[3]。結腸癌與大多數腫瘤一樣,缺乏特異性臨床表現,在早期難以發現,一經診斷患者已經處于中晚期,所以提高結腸癌的早期診斷率,尋找早期發生時的標志物,對結腸癌的臨床診療具有重要意義。微小RNA(microRNA,miRNA,miR)是一類高度保守的小分子非編碼RNA,在人體中參與絕大多數的生理及病理活動[4]。相關研究[5]發現,有200種以上的miRNA與腫瘤具有一定的相關性。有研究[6]證實,miRNA的異常表達參與了結腸癌的發生和發展。關于miR-193a-5p和miR-139-5p的表達在結腸癌中的相關報道較少,因此本研究檢測結腸癌患者血清miR-193a-5p和miR-139-5p的表達水平,分析其對預后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年5月至2020年1月就診于徐州醫科大學附屬常熟醫院的結腸癌患者109例為結腸癌組,其中男性68例,女性41例;平均年齡(61.43±8.94)歲;TNM 分期中,Ⅰ期24例,Ⅱ期 37例,Ⅲ期31例,Ⅳ期 17例;淋巴結轉移49例。選取同期體檢健康者100例為健康組,其中男性61例,女性39例;平均年齡(60.96±8.98)歲。兩組年齡、性別比較差異無統計學意義(均P>0.05)。納入標準:初次診斷為結腸癌患者;符合中國結直腸癌的診斷規范標準[7];經影像學及腸鏡活組織鏡檢確診;沒有其他惡性腫瘤疾病史;患者的臨床資料完整。排除標準:合并其他惡性腫瘤以及免疫性疾病;合并結直腸慢性或感染性疾病;伴有糖尿病、高血壓等慢性疾病。研究對象對本研究知情同意。本研究已通過醫院倫理委員會審批。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集:健康組于當日清晨抽取肘靜脈血5 ml,結腸癌患者于術前7 d抽取肘靜脈血5 ml。將肘靜脈血放入離心機中進行離心處理,離心速度3000 r/min,離心半徑13 cm,離心 10 min后分離上清液,儲存在-80 ℃冰箱中,待后續檢測使用。

1.2.2 血清miR-193a-5p和miR-139-5p檢測:加入1 ml的TRIzol(批號:20190916,北京索萊寶公司),提取總RNA,檢測RNA純度,采用反轉錄試劑盒(批號:A51472,美國Millipore 公司)獲得cDNA,采用實時熒光定量PCR檢測miR-193a-5p和miR-139-5p的表達水平。miR-193a-5p正向引物序列為5’-CTAAGTACAGTCTGATCCGTC-3’,反向引物序列為5’-CGTCGACCGGATAGATCA-3’。miR-139-5p正向引物序列為5’-CATCGCGCATGCTAGCTAGACC-3’,反向引物序列為5’-ATACGGCAACGTACGCGACG-CATA-3’。GAPDH作為內參,正向引物序列為5’-TAAGCTGTACCTATCAATTCC-3’, 反向引物序列為5’-GCGTAGCCTACGGTAAGCGATACGC-3’。PCR總反應體系25 μl,反應條件:95 ℃ 進行30 s,95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,68 ℃延伸1 min,共40個循環。根據2-△△Ct計算miR-193a-5p和miR-139-5p的表達量。以miR-193a-5p和miR-139-5p表達量的平均值1.74和1.69為界,將結腸癌患者分為miR-193a-5p高表達組和miR-193a-5p低表達組, 以及miR-139-5p高表達組和miR-139-5p低表達組。

1.2.3 隨訪:以電話或者門診的形式進行隨訪,隨訪日期截止到2022年6月,以患者死亡為隨訪終點。

1.3 觀察指標 比較兩組研究對象血清miR-193a-5p和miR-139-5p水平;觀察miR-193a-5p和miR-139-5p表達與臨床病理特征的關系;分析結腸癌患者預后不良的影響因素;觀察miR-193a-5p和miR-139-5p水平對患者5年總生存率的影響。

2 結 果

2.1 兩組血清miR-193a-5p和miR-139-5p表達比較 見表1。結腸癌組miR-193a-5p和miR-139-5p表達明顯低于健康組(均P<0.001)。

表1 兩組血清miR-193a-5p和miR-139-5p表達比較

2.2 血清miR-193a-5p和miR-139-5p表達與結腸癌患者臨床病理特征的相關性 見表2。結腸癌患者血清miR-193a-5p和miR-139-5p表達與性別、年齡、病理分型、腫瘤部位、腫瘤直徑無明顯相關性(均P>0.05),與臨床分期、分化程度、局部浸潤深度和淋巴結轉移具有明顯相關性(均P<0.001)。

表2 血清miR-193a-5p和miR-139-5p表達與結腸癌患者臨床病理特征的相關性

2.3 結腸癌患者預后影響因素分析 見表3。Cox風險比例模型分析結果顯示,臨床分期、分化程度、局部浸潤深度、淋巴結轉移、miR-193a-5p和miR-139-5p是結腸癌患者不良預后的影響因素(均P<0.05)。

表3 結腸癌患者預后影響因素分析

2.4 血清miR-193a-5p和miR-139-5p不同表達水平結腸癌患者總生存率比較 見圖1。miR-193a-5p低表達組5年總生存率為46.55%(27/58),miR-193a-5p高表達組5年總生存率為79.43%(40/51),miR-193a-5p低表達組5年總生存率明顯低于miR-193a-5p高表達組(χ2=7.194,P<0.05)。miR-139-5p低表達組5年總生存率為48.21%(27/56),miR-139-5p高表達組5年總生存率為73.58%(39/53),miR-139-5p低表達組5年總生存率明顯低于miR-139-5p高表達組(χ2=6.573,P<0.05)。

圖1 miR-193a-5p(左)和miR-139-5p(右)不同表達水平結腸癌患者生存曲線

3 討 論

結腸癌是在結腸內黏膜上生長的惡性腫瘤,增長的癌細胞侵犯結腸壁后會阻塞結腸,出現腹痛、便血、腸梗阻等癥狀。近年來,隨著經濟的發展和飲食結構的改變,我國的結腸癌發病率逐年上升,而且也呈年輕化趨勢。結腸癌的發生是多因素共同作用的結果,包括生活方式、飲食習慣、遺傳和環境等[8]。結腸癌的發生過程從正常的上皮到異常增生,再到腺瘤和癌變被稱為“腺瘤-癌變”學說[9]。除此之外,原癌基因的激活和抑癌基因的失活是結腸癌發生和發展的分子基礎,結腸癌的侵襲和轉移等過程和許多基因的變化有一定的關系[10]。

miRNA含有18～25個核苷酸,一般是在轉錄后調控各基因的表達[11]。相關研究[12]表明,miRNA可以調控結腸癌相關的基因和信號通路,從而抑制或者促進結腸癌的發生和發展。另有研究表明,miRNA在結腸癌的轉移中也起著至關重要的作用,可以通過相關的靶基因促進或者抑制結腸癌的轉移。miR-193a-5p在多種惡性腫瘤的發生、發展中發揮著重要的作用,并被揭示為腫瘤抑制劑及壁細胞轉化調節因子,如在胃癌[13]和肺癌[14]中的表達水平降低,起著抑癌基因的作用。miR-139-5p為由22個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA,在多種物種與組織中都有表達,并且高度保守,具有獨立啟動子[15]。相關研究表明,miR-139-5p在肝細胞癌、食管鱗癌等多種腫瘤細胞中表達下調并與腫瘤的轉移和侵襲有關。在體外實驗中,過表達miR-139-5p可明顯抑制肝癌細胞的遷移和侵襲能力[16];在食管鱗癌的早期診斷中,miR-139-5p在腫瘤中的表達下調也可以作為診斷食管癌的生物學指標之一[17]。關于miR-193a-5p和miR-139-5p表達在結腸癌中的臨床相關報道較少,因此本研究檢測結腸癌患者血清miR-193a-5p和miR-139-5p的表達水平并分析其對患者預后的影響。

本研究結果顯示,結腸癌組miR-193a-5p和miR-139-5p的表達均明顯低于健康組,患者血清miR-193a-5p和miR-139-5p表達水平與臨床分期、分化程度、局部浸潤深度和淋巴結轉移具有明顯的相關性,Ⅲ-Ⅳ期患者血清miR-193a-5p和miR-139-5p的表達低于Ⅰ-Ⅱ期,低分化患者血清中miR-193a-5p和miR-139-5p的表達低于中、高分化患者,局部浸潤深度T3-T4患者血清miR-193a-5p和miR-139-5p的表達低于T1-T2患者,淋巴結轉移患者血清miR-193a-5p和miR-139-5p的表達低于淋巴結未轉移的患者。為了驗證miR-193a-5p和miR-139-5p的表達對預后的影響,本研究采用Cox風險比例模型分析,結果顯示臨床分期、分化程度、局部浸潤深度、淋巴結轉移、miR-193a-5p和miR-139-5p是結腸癌患者預后的影響因素,而且miR-193a-5p低表達組患者5年總生存率明顯低于miR-193a-5p高表達組,miR-139-5p低表達組患者5年總生存率明顯低于miR-139-5p高表達組。以上結果說明,miR-193a-5p和miR-139-5p有助于結腸癌的篩查,可以作為預后評估的重要標志物。相關研究表明,血清miR-193a-3p可作為食管鱗狀細胞癌[18]和卵巢上皮癌[19]患者診斷或預后評估的潛在分子標志物。也有研究[20]報道,miR-139-5p在上皮性卵巢癌中表達下調并可能具有一定抑癌作用,可作為上皮性卵巢癌的預后指標或者治療靶標。

綜上所述,血清miR-193a-5p和miR-139-5p在結腸癌患者中的表達均明顯降低,可能在結腸癌中發揮著抑癌的作用。檢測血清中miR-193a-5p和miR-139-5p的表達水平有助于結腸癌患者診斷及預后的評估,可能成為結腸癌早期診斷和預后判斷的分子標志物。但本研究存在一定的不足,關于miR-193a-5p和miR-139-5p在結腸癌中的具體相關機制還有待于進一步研究。