免疫性血小板減少癥患兒T淋巴細胞亞群、甲狀腺自身抗體、微小RNA-106b-5p和微小RNA-181a-5p表達水平檢測及臨床意義

高長俊,張 晴,韓 靜

(唐山市婦幼保健院小兒血液科,河北 唐山 063000)

免疫性血小板減少癥(Immune thrombocytopenia,ITP)是一種自身免疫性出血性疾病,多發生于兒童,若未及時診治可致患兒病情進一步發展,嚴重威脅患兒生長發育及身體健康[1]。現階段,臨床治療兒童ITP主要以防止患兒嚴重出血為主,一般預后較為理想,但部分患兒仍會進展為難治性ITP,進而增加治療難度[2]。因此,有效探究兒童ITP發生、發展過程中的疾病相關因子表達水平變化,對患兒的預后評估意義重大。既往研究[3]發現,兒童ITP的發生與機體免疫失衡密切相關,但何種免疫因子參與疾病的進展過程尚無統一定論。T淋巴細胞亞群參與機體多項免疫應答過程[4]。甲狀腺球蛋白抗體(Thyroid globulin antibody,TGAb)、甲狀腺過氧化物酶抗體(Thyroid peroxidase antibody,TPOAb)作為甲狀腺自身抗體,參與機體的免疫炎性反應過程[5]。微小RNA-106b-5p(microRNA-106b-5p,miR-106b-5p)、miR-181a-5p作為一類調節因子,其表達水平影響機體免疫平衡狀態,在免疫細胞的發育和凋亡過程中具有重要作用[6]。但目前臨床關于T淋巴細胞亞群、TGAb、TPOAb、miR-106b-5p、miR-181a-5p在兒童ITP中的表達水平及其臨床意義仍需探究。基于此,本研究探討ITP患兒T淋巴細胞亞群、TGAb、TPOAb、miR-106b-5p、miR-181a-5p水平變化及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2022年12月唐山市婦幼保健院小兒血液科收治的ITP患兒158例為ITP組,依據ITP臨床分型[7]將患兒分為慢性ITP組(34例)、持續性ITP組(60例)和新診斷ITP組(64例)。ITP組男性80例,女性78例;年齡1個月至12歲,平均(30.90±10.01)個月;體重指數(BMI)19～22 kg/m2,平均(20.07±0.45)kg/m2。慢性ITP組男性19例,女性15例;年齡1個月至12歲,平均(30.92±10.07)個月;BMI 19～22 kg/m2,平均(19.86±0.41)kg/m2。持續性ITP組男31例,女29例;年齡1個月至12歲,平均(30.89±10.12)個月;BMI 19～22 kg/m2,平均(20.08±0.47)kg/m2。新診斷ITP組男性30例,女性34例;年齡1個月至12歲,平均(30.94±10.06)個月;BMI 19～22 kg/m2,平均(20.11±0.45)kg/m2。病例納入標準:所選患兒均符合《諸福棠實用兒科學(第8版)》[8]中關于小兒ITP的相關診斷標準;患兒家屬均對本研究知情同意。排除標準:既往應用過免疫抑制劑、激素藥物等治療者;伴有其他繼發性血小板減少癥者;伴有先天性疾病及嚴重惡性腫瘤者;伴有其他血液系統疾病包括急性白血病及溶血性貧血等者;伴有其他出血性疾病包括血友病及彌散性血管內凝血等者。另選取同期健康兒童102例為對照組,其中男性54例,女性48例;年齡2個月至13歲,平均(31.02±10.05)個月;BMI 19～22 kg/m2,平均(20.13±0.44)kg/m2。四組性別、年齡、BMI等基線資料比較差異無統計學意義(均P>0.05)。本研究獲唐山市婦幼保健院倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 治療方法:所有患兒均給予止血、抗感染等對癥支持治療。同時,給予靜脈滴注人免疫球蛋白(國藥準字S20053074)400 mg/(kg·d),治療5 d;口服醋酸潑尼松片(國藥準字H62020285)2 mg/kg,3次/d。治療至PLT>100×109/L后進行1～2周的穩定給藥,最后減停藥物。

1.2.2 T淋巴細胞亞群水平檢測:入院后1 d內,采集受試者空腹靜脈血10 ml,取5 ml全血采用Wmini 5268流式細胞儀測定全血CD3+、CD4+、CD8+細胞水平。

1.2.3 TGAb、TPOAb、miR-106b-5p、miR-181a-5p水平檢測:血液采集同1.2.2,取5 ml全血離心(半徑8 cm,速率3500 r/min,時間15 min),取2 ml血清采用Venus 120H全自動化學發光免疫分析儀測定血清TGAb、TPOAb水平(試劑盒批號:20180811、20180724,科來思生物科技重慶有限公司)。取剩余3 ml血清采用TRIzol法提取外周血總RNA,依據反轉錄試劑盒操作得到cDNA,參考實時熒光定量PCR試劑盒(批號:20170103,大連TaKaRa公司)操作定量各目的基因。miR-106b-5p正向引物序列為5’-ATGCTATCTCATACGTGTCA-3’,反向引物序列為5’-GATCCATAGTCGATCTGGAT-3’。miR-181a-5p正向引物序列為5’-CCGCGAACATTCAACGCTGTCG-3’, 反向引物序列為5’-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3’。 PCR擴增條件:95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,共40個循環。總反應體系:雙蒸餾水7.67 μl,cDNA 1.33 μl,Taq Man通用混合物溶液10 μl,20 μl引物及1 μl探針Mix。采用2-ΔΔCt法計算血清miR-106b-5p、miR-181a-5p相對表達水平。

1.3 觀察指標 比較ITP組與對照組全血T淋巴細胞亞群水平;比較ITP組與對照組血清TGAb、TPOAb、miR-106b-5p、miR-181a-5p水平;比較慢性ITP組、持續性ITP組、新診斷ITP組患兒全血T淋巴細胞亞群及血清TGAb、TPOAb、miR-106b-5p、miR-181a-5p水平;比較ITP患兒治療前、治療5 d后全血T淋巴細胞亞群及血清TGAb、TPOAb、miR-106b-5p、miR-181a-5p水平。

2 結 果

2.1 ITP組與對照組全血T淋巴細胞亞群水平比較 見表1。與對照組比較,ITP組全血CD3+、CD4+細胞水平更低,CD8+細胞水平更高(均P<0.05)。

表1 ITP組與對照組全血T淋巴細胞亞群水平比較(%)

2.2 ITP組與對照組血清TGAb、TPOAb、miR-106b-5p、miR-181a-5p水平比較 見表2。與對照組比較,ITP組血清TGAb、TPOAb、miR-106b-5p水平更高,miR-181a-5p水平更低(均P<0.05)。

表2 ITP組與對照組血清TGAb、TPOAb、miR-106b-5p、miR-181a-5p水平比較

2.3 不同臨床分型ITP患兒全血T淋巴細胞亞群及血清TGAb、TPOAb、miR-106b-5p、miR-181a-5p水平比較 見表3。慢性ITP組全血CD3+、CD4+細胞及血清miR-181a-5p水平低于持續性ITP組和新診斷ITP組,全血CD8+細胞及血清TGAb、TPOAb、miR-106b-5p水平高于持續性ITP組和新診斷ITP組(均P<0.05)。

表3 不同臨床分型ITP患兒全血T淋巴細胞亞群及血清TGAb、TPOAb、miR-106b-5p、miR-181a-5p水平比較

2.4 ITP患兒治療前、治療5 d后全血T淋巴細胞亞群及血清TGAb、TPOAb、miR-106b-5p、miR-181a-5p水平比較 見表4。與治療前比較,治療5 d后ITP患兒全血CD3+、CD4+細胞及血清miR-181a-5p水平升高,全血CD8+細胞及血清TGAb、TPOAb、miR-106b-5p水平降低(均P<0.05)。

表4 ITP患兒治療前、治療5 d后全血T淋巴細胞亞群及血清TGAb、TPOAb、miR-106b-5p、miR-181a-5p水平比較

3 討 論

ITP是兒童時期常見的出血性疾病之一,占兒童疾病總數的30%左右。該疾病起病隱匿,早期癥狀表現不典型[9]。盡管ITP可自行緩解,但仍有部分患兒容易進展為慢性ITP或難治性ITP,且經臨床治療后的療效欠佳,因此探究參與兒童ITP疾病進展過程的相關因子水平變化尤為重要[10]。多項研究[11-12]顯示,T淋巴細胞亞群、甲狀腺自身抗體及調節因子等在兒童ITP的發生與發展過程中發揮重要作用。因此,有效評估T淋巴細胞亞群、甲狀腺自身抗體及調節因子等在兒童ITP中的表達水平,對兒童ITP的病情診斷及療效評估意義重大。

T淋巴細胞亞群參與調節多種疾病的免疫反應,其中CD3+、CD4+、CD8+細胞水平變化可反映機體細胞免疫功能,三者可通過合成多種因子參與機體的多項免疫應答過程,維持機體的免疫平衡,但當CD3+、CD4+細胞水平降低而CD8+細胞水平升高時,可導致機體細胞免疫功能被破壞,引起免疫失衡,進而促使兒童ITP的發生[13-14]。本研究中與對照組及持續性ITP組、新診斷ITP組比較,ITP組和慢性ITP組全血CD3+、CD4+細胞水平更低,全血CD8+細胞水平更高,且治療5 d后ITP患兒全血CD3+、CD4+細胞水平升高,全血CD8+細胞水平降低,進一步提示ITP兒童存在T淋巴細胞亞群失衡情況,低水平的CD3+、CD4+細胞和高水平的CD8+細胞可促使患兒疾病進展,且治療期間積極檢測患兒全血CD3+、CD4+、CD8+細胞水平有助于患兒的療效評估。王學梅等[15]研究發現,T淋巴細胞亞群可參與兒童ITP的疾病進展過程,并可作為評估兒童ITP的重要指標,與本研究結果基本相符。

TGAb是一種主要存在于甲狀腺細胞內的糖蛋白,可參與自身免疫性疾病的發生、發展過程,正常情況下表達水平較低,但當機體發生甲狀腺病理損傷后可促使其合成增加,在血液中過量表達而加重機體的免疫損傷[16]。TPOAb作為診斷和評估自身免疫性甲狀腺疾病的敏感指標,與機體免疫功能關系密切,當機體免疫功能被破壞時可引起其釋放增加[17]。miR-106b-5p可參與自身免疫性疾病進展過程,影響機體免疫平衡狀態,正常生理狀況下表達水平較低,當機體免疫平衡狀態被打破時其呈異常高表達狀態[18]。miR-181a-5p是miR家族成員之一,在免疫細胞的生長發育中起到關鍵性作用,可參與調控多種免疫因子的表達,但當機體免疫失衡時可引起其低表達[19]。本研究中,與對照組及持續性ITP組、新診斷ITP組比較,ITP組和慢性ITP組血清miR-181a-5p水平更低,血清TGAb、TPOAb、miR-106b-5p水平更高,且治療5 d后ITP患兒血清miR-181a-5p水平升高,血清TGAb、TPOAb、miR-106b-5p水平降低,進一步提示ITP兒童存在TGAb、TPOAb、miR-106b-5p高表達及miR-181a-5p低表達情況,治療期間積極檢測患兒血清TGAb、TPOAb、miR-106b-5p、miR-181a-5p水平,有助于患兒的療效評估。王文芳等[20]研究指出,ITP患兒伴有miR-106b-5p水平升高現象,治療過程中積極測定患兒miR-106b-5p水平對療效判斷具有指導作用,與本研究結果基本相符。

綜上所述,ITP患兒存在T淋巴細胞亞群失衡、甲狀腺自身抗體和miR-106b-5p高表達以及miR-181a-5p低表達情況。治療期間積極檢測患兒全血T淋巴細胞亞群及血清甲狀腺自身抗體、miR-106b-5p、miR-181a-5p水平,有助于患兒的療效評估。