紫草素對糖尿病周圍神經病變大鼠的治療作用及對腺苷酸活化蛋白激酶/核因子E2相關因子2信號通路的影響

黎珊珊,區島良,張 梅,謝桃梅

(儋州市人民醫院內分泌科,海南 儋州 571700)

糖尿病周圍神經病變(Diabetic peripheral neuropathy,DPN)的特征是慢性疼痛、腳部和身體其他部位的感覺喪失[1-2]。許多長期糖尿病患者會并發DPN[3]。盡管在過去的幾十年中對DPN進行了廣泛的研究,但其發病機制仍有待確定。細胞氧化應激和炎癥是DPN的重要危險因素,但目前尚無有效的療法[4]。因此,迫切需要探索DPN的新臨床療法。研究[5]表明,持續性高血糖癥可能是神經炎癥和神經損傷導致神經性疼痛的主要原因。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)/核因子E2相關因子2(Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)信號通路是機體抵抗氧化應激、改善脂質沉積過程中的重要信號通路[6]。AMPK能調節炎癥和細胞穩態,調節脂肪酸生物合成,同時抑制炎性、氧化應激反應[7]。Nrf2是調節氧化還原的轉錄因子,參與抗氧化防御系統的調節[8]。紫草素是中藥紫草的主要活性成分,研究[9]表明其對多種惡性腫瘤的增殖、凋亡具有調控作用,同時還在抗炎、抗菌、傷口愈合等方面具有較好的藥理活性。但紫草素在DPN中的作用尚未可知,因此本研究基于AMPK/Nrf2信號通路探究紫草素對DPN大鼠的治療作用,為紫草素在DPN治療中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠,6～7周齡,體重241～262 g,購自江蘇康潤生物科技有限公司,生產許可證號:SCXK(蘇)2022-0007。所有大鼠飼養于溫度為20～24 ℃、相對濕度為48%～55%、12 h明/暗循環的環境中,自由飲水和進食。本研究經本院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器 紫草素(批號:BX19589,原料藥,純度≥99.5%)購自肇慶大華農生物藥品有限公司;甲鈷胺片(批號:20220116)購自衛材(中國)藥業有限公司;鏈脲佐菌素(STZ)、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、TRIzol試劑、反轉錄試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒、ECL試劑(批號:HQ18490、HQ21785、HQ14829、HQ25499、HQ24400、HQ42195)購自南寧華丘生物科技有限公司;腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、PCR試劑盒、蛋白裂解液(批號:SE25900、SE41857、SE22490、SE42589、SE47549、SE25488)購自天津賽爾生物技術有限公司;兔源AMPK、Nrf2、β-actin一抗、羊抗兔二抗(批號:DJ19401、DJ10045、DJ15811、DJ29541)購自南京東極生物科技有限公司。MD3000-D型生物信號采集處理系統、DRW-200BC型酶標儀、Primostar 3型顯微鏡購自廣東春盛生物科技發展有限公司;CFX Opus 96型熒光定量PCR儀、FluorChem Q型凝膠成像系統購自天津科斯莫生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 DPN模型構建構建[10-11]:給予大鼠高糖高脂飼料喂養8周,隨后禁食、禁水12 h,一次性于大鼠腹腔注射30 mg/kg STZ。于STZ注射1周后,檢測大鼠空腹血糖(FBG),若FBG≥16.7 mmol/L表示糖尿病大鼠造模成功,繼續使用高糖高脂飼料喂養大鼠。6周后,檢測大鼠尾部坐骨神經的感覺神經傳導速度(SNCV),若SNCV<30 m/s即表示DPN大鼠建模成功。

1.3.2 分組與給藥[12-13]:將建模成功的48只大鼠隨機分為模型組、紫草素低劑量組、紫草素高劑量組和甲鈷胺片組,每組12只。另取12只大鼠作為對照組。紫草素低、高劑量組大鼠分別給予12.5、25 mg/kg紫草素灌胃給藥(將紫草素與0.9%氯化鈉溶液混溶成濃度分別為1.25、2.5 mg/ml的混懸液,灌胃體積10 ml/kg);甲鈷胺片組大鼠給予0.14 mg/kg甲鈷胺片灌胃給藥(將甲鈷胺片和0.9%氯化鈉溶液混溶成濃度為0.014 mg/ml的混懸液,灌胃體積10 ml/kg);對照組和模型組大鼠灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液。各組每日給藥1次,連續8周。

1.3.3 坐骨神經SNCV和運動神經傳導速度(MNCV)測定:①末次給藥結束后24 h,麻醉大鼠,將大鼠俯臥位固定,暴露分離大鼠右側坐骨神經,在坐骨神經傳出部位放置刺激電極,在坐骨神經經過部位放置記錄電極,刺激電極與記錄電極之間放置參考電極,給予脈沖刺激,記錄從刺激開始到出現動作電位的時間(T1)和刺激與記錄電極之間的距離(S1),計算MNCV(MNCV=S1/T1)。②將記錄電極置于坐骨神經近端,刺激電極置于遠端,給予電刺激,記錄刺激由刺激電極傳導到記錄電極的時間(T2),測量兩電極之間的距離(S2),計算SNCV(SNCV= S2/T2)。

1.3.4 血清TNF-α、IL-6水平測定:大鼠腹主動脈采血3 ml,靜置后4 ℃下5600 r/min離心11 min,取上清,按照ELISA試劑盒說明書操作方法檢測血清中TNF-α、IL-6水平。

1.3.5 坐骨神經病理學變化檢測:處死大鼠,收集大鼠坐骨神經,分為兩部分。一部分置于-70 ℃保存。另一部分使用4%多聚甲醛固定,經脫水、石蠟包埋、切片(4 μm)后HE染色,顯微鏡下觀察坐骨神經病理學變化。

1.3.6 坐骨神經SOD、MDA水平測定:取1.3.5中大鼠坐骨神經,研磨勻漿,4 ℃下9200 r/min離心15 min,取上清檢測SOD、MDA水平。

1.3.7 坐骨神經AMPK、Nrf2 mRNA水平測定:取1.3.5中大鼠坐骨神經,勻漿后TRIzol試劑提取總RNA,反轉錄合成cDNA,熒光定量PCR法檢測大鼠坐骨神經AMPK、Nrf2 mRNA水平,內參為GAPDH。引物由南京卡爾文生物科技有限公司設計合成,引物序列見表1。反應條件、環境參照PCR試劑盒說明書配置,靶基因mRNA水平使用2-ΔΔCt法計算。

表1 基因引物序列

1.3.8 坐骨神經AMPK、Nrf2蛋白水平測定:取1.3.5中大鼠坐骨神經,勻漿后蛋白裂解液裂解,定量蛋白濃度,電泳、轉膜后脫脂奶封膜1 h,加入稀釋比為1∶1400的兔源AMPK、Nrf2、β-actin一抗,4 ℃下孵育過夜。加入稀釋比為1∶2200的羊抗兔二抗,室溫下孵育1 h,ECL試劑顯色,凝膠成像系統拍照,計算大鼠坐骨神經AMPK、Nrf2蛋白水平(內參為β-actin)。

2 結 果

2.1 各組大鼠坐骨神經SNCV、MNCV比較 見表2。與對照組比較,模型組大鼠坐骨神經SNCV、MNCV顯著降低(均P<0.05)。與模型組比較,紫草素低、高劑量組大鼠坐骨神經SNCV、MNCV依次升高(均P<0.05)。甲鈷胺片組和紫草素高劑量組大鼠坐骨神經SNCV、MNCV比較差異無統計學意義(均P>0.05)。

表2 各組大鼠坐骨神經SNCV、MNCV比較(m/s)

2.2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 見表3。與對照組比較,模型組大鼠血清TNF-α、IL-6水平顯著升高(均P<0.05)。與模型組比較,紫草素低、高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6水平依次降低(均P<0.05)。甲鈷胺片組和紫草素高劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平比較差異無統計學意義(均P>0.05)。

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較(pg/ml)

2.3 各組大鼠坐骨神經病理學變化 見圖1。對照組大鼠坐骨神經結構正常。模型組大鼠坐骨神經髓鞘變薄,出現白色結締物質,間隙加寬,可見明顯炎癥細胞浸潤。紫草素低、高劑量組大鼠坐骨神經上述病變程度依次減輕。甲鈷胺片組和紫草素高劑量組大鼠坐骨神經病變程度無明顯差異。

圖1 各組大鼠坐骨神經HE染色結果(×400)

2.4 各組大鼠坐骨神經SOD、MDA水平比較 見表4。與對照組比較,模型組大鼠坐骨神經SOD水平顯著降低,MDA水平顯著升高(均P<0.05)。與模型組比較,紫草素低、高劑量組大鼠坐骨神經SOD水平依次升高,MDA水平依次降低(均P<0.05)。甲鈷胺片組和紫草素高劑量組大鼠坐骨神經中SOD、MDA水平比較差異無統計學意義(均P>0.05)。

表4 各組大鼠坐骨神經SOD、MDA水平比較

2.5 各組大鼠坐骨神經AMPK、Nrf2 mRNA和蛋白水平比較 見表5。與對照組比較,模型組大鼠坐骨神經AMPK、Nrf2 mRNA和蛋白水平顯著降低(均P<0.05)。與模型組比較,紫草素低、高劑量組大鼠坐骨神經AMPK、Nrf2 mRNA和蛋白水平依次升高(均P<0.05)。甲鈷胺片組和紫草素高劑量組大鼠坐骨神經AMPK、Nrf2 mRNA和蛋白水平比較差異無統計學意義(均P>0.05)。

表5 各組大鼠坐骨神經AMPK、Nrf2 mRNA和蛋白水平比較

3 討 論

DPN常見的類別為糖尿病感覺運動多發神經病變,其發病能影響外周神經系統感覺、運動、自主神經功能[14]。目前,DPN有效的治療方法較少,其治療方向以控制血糖、改善疼痛為主。同時,DPN的發病機制較為復雜,涉及氧化應激、炎癥反應、糖代謝紊亂等[15]。DPN患者通常有感覺功能障礙,常表現為兩側肢體感覺異常,嚴重時還可能導致肢體肌肉萎縮。神經組織對氧化應激敏感度較高,高糖環境能誘導大量活性氧的產生,從而導致氧化應激的發生,在這一過程中誘發的炎癥反應和細胞凋亡導致了神經元的損傷[16]。

紫草素可從中藥紫草中提取出來,其生物學活性廣泛,包括抗炎、增強機體免疫力等[17]。紫草素在治療神經功能損傷方面也有一定的作用。陳夢月等[18]研究表明,紫草素能夠減少氧糖剝奪誘導的大鼠原代皮層神經元凋亡。本研究結果顯示,對照組大鼠坐骨神經結構正常;模型組大鼠坐骨神經髓鞘變薄,出現白色結締物質,間隙加寬,可見明顯炎癥細胞浸潤;坐骨神經SNCV、MNCV和SOD水平顯著降低,血清TNF-α和IL-6水平、坐骨神經MDA水平顯著升高,表明DPN大鼠發生坐骨神經病變,同時伴隨炎癥反應和氧化應激。而紫草素處理后的DPN大鼠坐骨神經上述病變程度減輕,坐骨神經SNCV、MNCV和SOD水平顯著升高,血清TNF-α和IL-6水平、坐骨神經MDA水平顯著降低,且呈現劑量依賴性,表明紫草素能抑制DPN大鼠炎癥反應和氧化應激,保護大鼠坐骨神經,從而使大鼠坐骨神經SNCV、MNCV恢復正常。

AMPK/Nrf2信號通路與機體抵抗氧化應激和炎癥反應密切相關。姬改娜等[19]研究表明,激活AMPK/Nrf2通路能夠減輕急性肺損傷新生大鼠肺組織氧化應激,保護大鼠肺組織。Dai等[20]研究發現,激活AMPK/Nrf2信號傳導能夠抑制炎癥反應和氧化應激,可以減輕七氟醚誘導的小膠質細胞炎癥損傷。AMPK/Nrf2信號通路也和神經損傷關系密切。Zhao等[21]研究表明,激活AMPK/Nrf2信號通路能夠防止氧糖剝奪/復氧復糖誘導的神經元損傷。Wang等[22]研究發現,激活AMPK/Nrf2信號通路能在氧糖剝奪/復氧復糖導致的神經元損傷模型中減少細胞凋亡和活性氧的產生,從而起到保護神經元的作用。本研究構建DPN模型大鼠,結果發現DPN大鼠坐骨神經AMPK、Nrf2 mRNA和蛋白水平較對照組大鼠顯著降低,紫草素處理后的DPN大鼠坐骨神經AMPK、Nrf2 mRNA和蛋白水平顯著升高且呈現劑量依賴性。

綜上所述,紫草素能抑制DPN大鼠炎癥反應和氧化應激,保護大鼠坐骨神經,其機制可能與激活AMPK/Nrf2信號通路有關。但本研究尚存在不足之處,未設置AMPK/Nrf2信號通路抑制劑來進一步驗證,而且紫草素也可能通過其他通路發揮保護作用,這都有待后續深入研究。