羅哌卡因對骨肉瘤細胞增殖、侵襲及雷帕霉素靶蛋白/缺氧誘導因子1α信號通路的影響

張素冰,高 輝,趙濱濱,張丹琦

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院麻醉手術科,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學附屬第三醫院麻醉手術科,黑龍江 哈爾濱 150040)

骨肉瘤是一種惡性梭形細胞腫瘤,具有不成熟的骨樣組織,好發于青少年,疾病引發的疼痛癥狀會被誤認為是成長引起的,在性別發病率上男性遠多于女性[1-2]。骨肉瘤具有惡性程度強、侵襲、轉移快且早的特點,具有較高致死率,患者預后差,即使手術切除后仍有復發與遠處轉移風險,長期生存率無顯著提高[3]。因此,治療藥物的進一步篩選及相關信號通路機制的探索仍是臨床研究的熱點。羅哌卡因是臨床麻醉、鎮痛類藥物,屬于左旋長效酰胺類藥物。研究[4-5]認為手術途中使用麻醉藥物對降低乳腺癌、食管鱗癌等癌癥復發有幫助。朱婧等[6]研究認為羅哌卡因可降低胃癌細胞(MGC-803)增殖并阻滯細胞周期。有關羅哌卡因對骨肉瘤的作用還未研究,羅哌卡因是否會對骨肉瘤細胞增殖與轉移有影響?本研究將對此展開研究。雷帕霉素靶蛋白(Rapamycin target of rapamycin,mTOR)是骨肉瘤經典致癌通路之一,其激活可調控下游靶基因參與對腫瘤進程的影響[7]。缺氧誘導因子1α(Hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)在胃癌[8]、肺癌[9]等多種腫瘤中存在高表達,腫瘤細胞惡性增殖會導致體內氧缺失,此環境下促使HIF-1α水平升高,為腫瘤細胞提供生長環境,促進腫瘤的轉移,其亦是mTOR的關鍵下游因子[10]。基于此,本研究探討羅哌卡因對骨肉瘤細胞的影響及其與mTOR/HIF-1α通路的關系,為骨肉瘤治療的藥物及通路研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要細胞與試劑 MG63細胞(CL-0157)購自普諾賽公司;羅帕卡因(T54853)購自上海源葉公司;Ki-67(ab21700)、基質金屬蛋白酶2(MMP-2,ab92536)、MMP-9(ab283575)、mTOR(ab32028)、HIF-1α(ab51608)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH,ab9485)抗體、羊抗兔IgG二抗(ab6721)購自美國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及MG63細胞增殖抑制率檢測:常規培養人骨肉瘤MG63細胞并傳代處理。取對數生長期的MG63細胞,以每孔2×104個細胞數的密度在96孔板中接種,分別加入終濃度為0、2.5、5、12、25、50、100、200、400 μg/ml的羅哌卡因溶液[6](DMEM培養基稀釋)。48 h后,每孔加入100 μl CCK-8試劑(避免氣泡生成)。孵育2 h后,測定450 nm處吸光值,檢測MG63細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.2 MG63細胞分組:將對數期MG63細胞分為對照組、羅哌卡因低濃度組、羅哌卡因中濃度組、羅哌卡因高濃度組。對照組細胞常規培養。羅哌卡因低、中、高濃度組分別在培養基中加入50、100、200 μg/ml濃度的羅哌卡因。

1.2.3 MG63細胞平板克隆率檢測:收集1.2.2中四組MG63細胞,按照每孔200個細胞密度在24孔板中接種,在37 ℃、5% CO2培養箱內培養14 d,注意及時更換培養液(每3 d換液1次)。培養結束后對細胞固定(多聚甲醛)并染色(1%結晶紫),PBS沖洗干凈后拍照。克隆形成率=克隆細胞數/接種細胞數×100%。

1.2.4 MG63細胞Ki-67表達檢測:將適量MG63細胞在24孔板中接種,PBS洗滌3次,多聚甲醛(4%)固定細胞,過氧化氫浸泡10 min,PBS洗滌后封閉,加入稀釋的Ki-67抗體(PBS稀釋,1∶100)孵育過夜。洗滌后加入山羊抗鼠二抗,37 ℃孵育1 h,PBS溶液洗滌,加入DAB顯色,蘇木精復染。經分化、透明、封片后,顯微鏡下觀察染色情況。選取5個獨立視野,計數陽性細胞數(黃褐色)。Ki-67陽性率=陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.2.5 MG63細胞侵襲、遷移能力檢測:侵襲實驗中,將Matrigel膠加入Transwell小室,37 ℃條件下進行3 h固化,并加入5×104個MG63細胞。將500 μl DMEM培養基添加到下室中,培養箱孵育24 h。多聚甲醛(4%)固定,結晶紫染色20 min,PBS洗滌2次,拍照并觀察MG63細胞侵襲數目。遷移實驗中,Transwell小室中不加入Matrigel膠,其余操作同侵襲實驗。

1.2.6 MG63細胞MMP-2、MMP-9、mTOR、HIF-1α蛋白表達檢測:收集各組MG63細胞,按照每孔3×106個細胞數量接種于24孔板中,37 ℃、5% CO2培養箱中培養,24 h后采用BCA蛋白試劑盒對蛋白質定量。SDS-PAGE分離蛋白質,轉移至PVDF上(濕轉法),封閉1 h,添加MMP-2(1∶1000)、MMP-9(1∶1000)、mTOR(1∶1000)、HIF-1α(1∶1000)、GAPDH(內參,1∶5000),孵育過夜。洗滌后添加羊抗兔IgG(1∶5000)2 h。ECL顯影,測定蛋白灰度值。

2 結 果

2.1 羅哌卡因對骨肉瘤細胞增殖的影響 0、2.5、5、12、25、50、100、200、400 μg/ml濃度的羅哌卡因作用于MG63細胞后,對MG63細胞增殖抑制情況不同。當羅哌卡因濃度≤25 μg/ml時,MG63細胞增殖抑制率均<90%;當羅哌卡因濃度≥50 μg/ml時,MG63細胞增殖抑制率顯著升高,且隨羅哌卡因濃度升高,增殖抑制率呈上升趨勢(P<0.05);當羅哌卡因濃度為100 μg/ml時,細胞增殖抑制率接近50%。因此,本研究分別選取50、100、200 μg/ml的羅哌卡因作為后續處理的低、中、高濃度。

2.2 羅哌卡因對MG63細胞克隆形成率的影響 見圖1。對照組及羅哌卡因低、中、高濃度組MG63細胞克隆形成率依次為(44.32±6.33)%、(31.53±4.50)%、(22.02±3.14)%和(13.52±1.93)%。與對照組比較,羅哌卡因低、中、高濃度組MG63細胞克隆形成率降低(均P<0.05)。與羅哌卡因低濃度組比較,羅哌卡因中、高濃度組MG63細胞克隆形成率降低(均P<0.05)。與羅哌卡因中濃度組比較,羅哌卡因高濃度組MG63細胞克隆形成率降低(P<0.05)。

圖1 四組MG63細胞平板克隆實驗結果(結晶紫染色)

2.3 羅哌卡因對Ki-67的影響 見圖2。對照組及羅哌卡因低、中、高濃度組MG63細胞Ki-67陽性率依次為(46.72±7.72)%、(25.43±4.25)%、(17.24±3.05)%和(8.16±1.36)%。與對照組比較,羅哌卡因低、中、高濃度組Ki-67陽性率降低(均P<0.05)。與羅哌卡因低濃度組比較,羅哌卡因中、高濃度組MG63細胞Ki-67陽性率降低(均P<0.05)。與羅哌卡因中濃度組比較,羅哌卡因高濃度組MG63細胞Ki-67陽性率降低(P<0.05)。

圖2 四組MG63細胞Ki-67免疫組化染色結果(×200)

2.4 羅哌卡因對MG63細胞侵襲和遷移的影響 見表1(圖3)。與對照組比較,羅哌卡因低、中、高濃度組MG63細胞侵襲細胞數和遷移細胞數降低(均P<0.05)。與羅哌卡因低濃度組比較,羅哌卡因中、高濃度組MG63細胞侵襲細胞數和遷移細胞數降低(均P<0.05)。與羅哌卡因中濃度組比較,羅哌卡因高濃度組MG63細胞侵襲細胞數和遷移細胞數降低(P<0.05)。

表1 四組MG63細胞侵襲細胞數和遷移細胞數比較(個)

圖3 四組MG63細胞Transwell實驗結果(結晶紫染色,×100)

2.5 羅哌卡因對MG63細胞侵襲相關蛋白的影響 見表2。與對照組比較,羅哌卡因低、中、高濃度組MG63細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達降低(均P<0.05)。與羅哌卡因低濃度組比較,羅哌卡因中、高濃度組MG63細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達降低(均P<0.05)。與羅哌卡因中濃度組比較,羅哌卡因高濃度組MG63細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達降低(均P<0.05)。

表2 四組MG63細胞MMP-2和MMP-9表達比較

2.6 羅哌卡因對MG63細胞mTOR/HIF-1α通路的影響 見表3。與對照組比較,羅哌卡因低、中、高濃度組MG63細胞mTOR和HIF-1α蛋白表達降低(均P<0.05)。與羅哌卡因低濃度組比較,羅哌卡因中、高濃度組MG63細胞mTOR和HIF-1α蛋白表達降低(均P<0.05)。與羅哌卡因中濃度組比較,羅哌卡因高濃度組MG63細胞mTOR和HIF-1α蛋白表達降低(均P<0.05)。

表3 四組MG63細胞mTOR/HIF-1α通路蛋白比較

3 討 論

骨肉瘤是嚴重威脅青少年生存期與生存質量的骨性癌癥[11]。手術切除與化療聯合治療是骨肉瘤的常規治療手段,實現保肢抑癌作用。麻醉藥物可發揮對癌細胞的抑制作用已經過大量實驗驗證。例如,2、10、50 ng/ml舒芬太尼均可抑制宮頸癌細胞增殖與轉移[12];丙泊酚可通過對miR-133a的調控參與對乳腺癌細胞增殖與侵襲的抑制[13];異丙酚抑制Wnt/β-catenin通路抑制乳腺癌細胞增殖[14]。

羅哌卡因是氨基酰類麻醉藥,在臨床中主要用分娩、術后鎮痛[15-16]。除鎮痛作用外,羅哌卡因也可發揮對癌細胞的抑制作用。陳穎等[17]研究顯示,羅哌卡因可通過抑制癌細胞線粒體呼吸作用,劑量依賴性地抑制人甲狀腺癌細胞增殖,并誘導甲狀腺癌細胞凋亡。張摯等[18]研究顯示,羅哌卡因可作用于乳腺癌腫瘤微環境,發揮對乳腺癌轉歸的影響,提高乳腺癌患者的生存時間。本研究選取0～400 μg/ml濃度的羅哌卡因作用于MG63細胞,發現0～25 μg/ml的羅哌卡因不對MG63細胞產生明顯增殖抑制作用,當羅哌卡因濃度高于25 μg/ml時,MG63細胞的增殖抑制率逐漸升高,即一定濃度的羅哌卡因可抑制MG63細胞增殖,因羅哌卡因濃度為100 μg/ml時細胞增殖抑制率接近50%,因此選取50、100、200 μg/ml的羅哌卡因作為研究濃度。本研究顯示,低、中、高濃度的羅哌卡因均可降低MG63細胞克隆形成率,抑制MG63細胞的增殖潛力,影響MG63細胞對生存環境的適應性。骨肉瘤的高轉移性是患者術后易復發的關鍵原因,其高轉移性與腫瘤細胞的侵襲、轉移能力有關,因此治療藥物的抑制侵襲轉移能力是重要特征之一,本研究中經低、中、高濃度的羅哌卡因處理后,MG63細胞的侵襲細胞數和遷移細胞數均降低,即羅哌卡因具有抑制MG63細胞轉移的能力。Ki-67是增殖相關抗原,與細胞的有絲分裂有關,在腫瘤的惡性增殖中不可或缺,本研究通過免疫組化法檢測不同組別間Ki-67表達情況,發現經羅哌卡因處理后MG63細胞Ki-67陽性率降低,進一步說明了羅哌卡因可抑制MG63細胞增殖。MMP-2和MMP-9是重要的腫瘤細胞侵襲轉移蛋白,可降解細胞外基質,破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障,在腫瘤浸潤中發揮關鍵作用。本研究中羅哌卡因處理后MG63細胞MMP-2和MMP-9蛋白水平顯著下降,提示羅哌卡因可降低MG63細胞的侵襲能力。

腫瘤細胞的惡性增殖往往伴隨環境內氧缺失,氧缺失會導致HIF-1α水平升高,因此胃癌、肺癌等多種腫瘤組織中可見HIF-1α水平升高。mTOR是HIF-1α的關鍵上游,參與多種癌癥的經典致癌途徑,可整合多種細胞外信號刺激,從而調節細胞功能,骨肉瘤中可見mTOR通路的激活。王華磊等[19]研究認為,雷帕霉素通過mTOR/HIF-1α通路調控人骨肉瘤細胞凋亡。Rathore等[20]認為,靶向mTOR是治療骨肉瘤的新方法。本研究中,經羅哌卡因處理后,MG63細胞mTOR和HIF-1α水平均降低,提示羅哌卡因可抑制mTOR/HIF-1α通路的激活。

綜上所述,羅哌卡因可抑制MG63細胞增殖、侵襲、轉移,并可抑制mTOR/HIF-1α通路的激活。但本研究僅探討了羅哌卡因與mTOR/HIF-1α的關系,羅哌卡因是否能通過mTOR/HIF-1α參與對MG63細胞的調控仍未可知,下一步將對此展開探討。