獨立生長因子1負調控GREM1基因抑制肝星狀細胞增殖與活化實驗研究

劉 剛,朱冬梅,趙 芹,劉曉玲,彭 洪

(1.南充市中心醫院 川北醫學院第二臨床醫學院超聲科,四川 南充637000;2.川北醫學院,四川 南充 637000;3.南充市中心醫院普外科,四川 南充 637000)

活化的肝星狀細胞(Hepatic stellate cell,HSC)可以在肝臟中產生過多的細胞外基質蛋白,導致肝纖維化并進展為肝硬化,從而增加患肝細胞癌的風險。雖然每年約有100萬人死于肝硬化,但目前肝纖維化尚無特異性治療方法[1]。肝臟中的炎癥持續發展可刺激并激活HSC,而活化的HSC可分化為肌成纖維細胞并分泌細胞外基質蛋白,如膠原蛋白和纖維連接蛋白[2]。因此,活化的HSC是肝纖維化的潛在治療靶點[3]。

GREM1基因編碼的Gremlin-1蛋白是一種分泌性糖蛋白,屬于DAN/Cerberus蛋白家族,是半胱氨酸結超家族的成員之一[4]。GREM1參與胚胎發生、骨形成和器官發育,在病理狀態下參與器官纖維化、炎癥和腫瘤的發生,更重要的是可誘導器官纖維化[5-6]。然而,GREM1與HSC活化及肝纖維化的關系尚不明確。

獨立生長因子1(Growth factor independence 1,GFI1)是一個轉錄因子,在其N端含有“SNAG”轉錄阻遏結構域,因此其主要是作為轉錄阻遏物發揮作用的[7]。GFI1可與DNA結合,招募染色質修飾酶如組蛋白脫乙酰酶、賴氨酸特異性脫甲基酶-1及抑制基因表達[8]。然而,GFI1參與HSC活化及增殖的研究未見報道。

我們前期通過分析GEO數據庫中的GSE68000數據集發現,GREM1在活化的HSC中明顯高表達,本研究則探討GFI1通過負調控GREM1基因表達對HSC增殖和活化的影響,旨在為肝纖維化治療提供新的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 HSC細胞株LX-2(批號:AC337957)購自美國菌種保藏中心;10%胎牛血清(批號:10270106)購自ThermoFisher公司;細胞計數試劑盒-8(CCK-8,批號:HY-K0301)購自MCE中國;Lipofectamine 3000試劑盒(批號:L3000001)購自Thermo Fisher公司;兔抗α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體(批號:BN42131R)購自Biorigin公司;山羊抗兔IgG抗體(批號:6927-100)購自Biovision公司;β-actin(批號:A5441)購自Merck公司。

1.2 細胞培養 LX-2細胞在RPMI 1640培養基與10%胎牛血清及含有1%青霉素/鏈霉素的溶液中培養。培養箱溫度為37 ℃并含有5% CO2。當細胞長滿80%時進行傳代。隨后根據實驗要求進行處理。

1.3 細胞轉染 由Gene Pharma(中國上海)合成并構建GREM1過表達載體(OE-GREM1)、GFI1 siRNA和GREM1 siRNA。LX-2細胞在6孔板中進行培養,至長滿80%時使用Lipofectamine 3000將OE-GREM1、GFI1 siRNA和GREM1 siRNA轉染至LX-2細胞。GFI1 siRNA序列:5’-GCUCGGAGUUUGAGGACUU-3’;Gremlin1-siRNA序列:5’-CCGGATACCTGAAGC-GAGATTGGTCTCGAGACCAATCTCGCTTCAGG-TATTTTTTG-3’。

1.4 生物信息學分析 下載Fun Rich 3.1.3軟件并安裝后,在Gene enrichment模塊下點擊“Analysis”,選擇Transcription factor(轉錄因子)進行預測。

1.5 CCK-8實驗 將處理好的細胞置于96孔板(1×105/ml),并在5% CO2和37 ℃條件下培養24 h。隨后在每孔中添加10 μl CCK-8試劑,并將混合物保持在相同條件下培養24、48、72 h。最后,使用微孔板閱讀器測量每個孔在450 nm處的吸光度。分析GREM1對LX-2細胞增殖的影響時分為空白對照組(不進行處理)、陰性對照組(NC)和GREM1過表達組(轉染OE-GREM1);分析GFI1對LX-2細胞增殖的影響時分為空白對照組(不進行處理)、陰性對照組(NC)和GFI1 siRNA組(轉染GFI1 siRNA);分析GFI1通過負調控GREM1影響LX-2細胞增殖活性時分為空白對照組(不進行處理)、陰性對照組(NC)、GFI1 siRNA組(轉染GFI1 siRNA)和GFI1 siRNA+GREM1 siRNA組(同時轉染GFI1 siRNA和GREM1 siRNA)。

1.6 Western blot實驗 用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物的放射免疫沉淀分析(RIPA)緩沖液對處理好的細胞進行裂解,將裂解液在4 ℃、10000 g下離心10 min后收集上清液。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質,然后將樣本轉移到PVDF膜上,并在含有0.05% Tween-20的Tris緩沖液鹽水中用2% BSA封閉。在室溫下用特定的一級抗體孵育膜1 h,再用二抗在室溫下孵育1 h。使用增強發光檢測試劑盒檢測蛋白條帶并進行密度測定分析。分析GREM1對α-SMA蛋白表達的影響時分為空白對照組(不進行處理)、陰性對照組(NC)和GREM1過表達組(轉染OE-GREM1);分析GFI1對α-SMA蛋白表達的影響時分為陰性對照組(NC)和GFI1抑制組(轉染GFI1 siRNA);分析GFI1通過負調控GREM1影響α-SMA蛋白表達時分為空白對照組(不進行處理)、陰性對照組(NC)、GFI1 siRNA組(轉染GFI1 siRNA)和GFI1 siRNA+GREM1 siRNA組(同時轉染GFI1 siRNA和GREM1 siRNA)。

1.7 染色質免疫共沉淀(CHIP)實驗 收集處理好的細胞,在4 ℃以12000 r/min離心15 min,用超聲破碎儀處理,取10 μl上清液作為對照,余下上清液加入2 μg GFI1一抗(實驗組)和相應的兔IgG(對照組),4 ℃孵育過夜。向樣品中加入預處理的磁珠,離心洗滌后加入蛋白酶K分離DNA和蛋白。進行PCR檢測,采用2-ΔΔCt法計算GREM1在實驗組基因轉錄水平相當于對照組的倍數。

1.8 實時熒光定量PCR (qRT-PCR)實驗 收集處理好的細胞,使用Trizol法提取總RNA。根據Takara反轉錄試劑盒的說明反轉錄獲得cDNA,并使用SYBR法進行qRT-PCR檢測。反應條件:95 ℃變性30 s;95 ℃ 10 s,循環40次;60 ℃退火持續30 s。GAPDH被用于內參基因。采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。GREM1正向引物序列為5’-GGCGAAACAAACATGGTGCA-3’,反向引物序列為5’-CGGCCCAGTGTTCAGACTAC-3’。分析GFI1對GREM1表達的影響時分為空白對照組(不進行處理)、陰性對照組(NC)和GFI1 siRNA組(轉染GFI1 siRNA)。

2 結 果

2.1 GREM1促進LX-2細胞增殖 見圖1。與空白對照組和陰性對照組比較,GREM1過表達組LX-2細胞增殖能力明顯增強(均P<0.05)。

注:與空白對照組和陰性對照組比較,*P<0.001

2.2 GREM1促進α-SMA蛋白表達 見圖2。Western blot結果提示,空白對照組和陰性對照組α-SMA蛋白相對表達水平分別為793.77±4.21、784.85±4.67,GREM1過表達組α-SMA蛋白相對表達水平為6755.26±8.11。與空白對照組和陰性對照組比較,GREM1過表達組α-SMA蛋白相對表達水平明顯增高(均P<0.05)。

圖2 GREM1促進α-SMA蛋白表達

2.3 GREM1轉錄因子分析 通過Fun Rich 3.1.3軟件分析GREM1的上游轉錄因子發現,轉錄因子12 (TCF12)、獨立生長因子1 (GFI1)、Meis同源框蛋白2(MEIS2)、 LIM/同源域2 (ISL2)、整聯蛋白 (ITGAL)、NK3同源盒1 (NKX3)可能是GREM1的轉錄因子,我們選擇GFI1進一步研究。通過qRT-PCR檢測CHIP實驗獲得的DNA樣品中GREM1表達量,結果提示與對照組(0.11±0.01)比較,實驗組GREM1表達水平(2.07±0.48)明顯增高(P<0.05),證實GFI1可與GREM1直接結合。

2.4 GFI1負調控GREM1表達 見圖3。qRT-PCR結果顯示,與空白對照組和陰性對照組比較,GFI1 siRNA組GREM1表達水平明顯增高(均P<0.05)。

注:與空白對照組和陰性對照組比較,*P<0.01

2.5 GFI1抑制LX-2細胞增殖 見圖4。CCK-8實驗結果顯示,與空白對照組和陰性對照組比較,GFI1 siRNA組LX-2細胞的增殖能力明顯增強(均P<0.05)。

注:與空白對照組和陰性對照組比較,*P<0.01

2.6 GFI1下調α-SMA蛋白表達 見圖5。Western blot結果顯示,與陰性對照組(1287.10±12.67)比較,GFI1抑制組α-SMA蛋白相對表達水平(2157.85±12.03)明顯增高(均P<0.05)。

圖5 GFI1對α-SMA蛋白表達的影響

2.7 GFI1通過負調控GREM1抑制LX-2細胞增殖 見圖6。與空白對照組和陰性對照組比較,GFI1 siRNA組細胞增殖能力明顯增強,但是與GFI1 siRNA組比較,GFI1 siRNA+GREM1 siRNA組細胞增殖能力有所降低(均P<0.05)。

注：與空白對照組和陰性對照組比較,*P<0.001;與GFI1 siRNA組比較,#P<0.01

2.8 GFI1通過負調控GREM1抑制α-SMA蛋白表達 見圖7。與空白對照組(265.49±8.50)和陰性對照組(271.75±14.39)比較,GFI1 siRNA組中α-SMA蛋白表達水平(2316.84±13.35)明顯增高,但GFI1 siRNA+GREM1 siRNA組α-SMA蛋白表達水平(1466.91±34.73)低于GFI1 siRNA組(均P<0.05)。

圖7 GFI1通過負調控GREM1抑制α-SMA蛋白表達

3 討 論

肝纖維化是對大多數慢性肝損傷(如非酒精性脂肪性肝炎、病毒性肝炎和酒精性脂肪性肝炎)的可逆修復反應[9-11]。隨著慢性肝病發展為肝硬化,HSC的激活可導致肝實質改變和血管生成異常[12]。活化的HSC在肝纖維化過程中發揮著最重要的作用,因此研究誘導HSC活化的機制對于靶向HSC的抗纖維化治療具有重要意義。

GREM1是一種骨形態生成蛋白拮抗劑,其可直接結合并抑制骨形態發生蛋白2(BMP2)和BMP4,還可以與血管內皮細胞生長因子受體2(VEGFR2)結合并促進血管生成[13-15]。既往研究[16-17]證實,GREM1可以通過調節信號轉導及轉錄激活蛋白3 (STAT3)-基質金屬蛋白酶3(MMP3)信號通路參與上皮間質轉化(EMT),而EMT是GREM1誘導器官纖維化的必備過程之一,并且GREM1還可以靶向蛋白質磷酸酶2調節亞基3A(PPP2R3A)促進成纖維細胞的增殖和遷移,參與肺纖維化,但是GREM1與肝纖維化發生、發展的關系尚無相關報道。通過分析GSE68000數據集我們發現,GREM1在活化的HSC中高表達,并且GREM1還可以促進HSC增殖及提高LX-2細胞α-SMA蛋白表達水平。因為HSC在正常肝臟中不表達α-SMA蛋白,所以α-SMA蛋白表達水平增高是HSC被激活的標志。我們的研究結果表明,GREM1可促進HSC增殖及活化HSC,證實GREM1參與肝纖維化的發生與發展。

轉錄因子是能夠與基因5’端特定序列結合并正調控或負調控基因表達的蛋白質分子[18-19]。我們通過生物信息學分析發現,GFI1可與GREM1靶向結合。GFI1是轉錄抑制因子,其蛋白質的N末端有一個高度保守的SNAIL/GFI1(SNAG)結構域,該結構域與其他轉錄抑制因子共享形成一個獨特但更大的SNAG蛋白亞家族,并通過向GFI1靶基因的調控區募集染色質修飾復合物介導轉錄抑制[20]。本研究發現,GFI1可降低LX-2細胞的增殖能力及下調α-SMA蛋白表達,證實GFI1可抑制肝纖維化。我們通過生物信息學分析發現,GFI1可能是GREM1的轉錄因子,而CHIP實驗則證實GFI1可與GREM1直接結合,并且GFI1可負調控GREM1表達。拯救實驗結果表明,與空白對照組和陰性對照組比較,GFI1 siRNA組LX-2細胞增殖能力明顯增強,α-SMA蛋白表達水平也明顯增高,但是和GFI1 siRNA組比較,GFI1 siRNA+GREM1 siRNA組細胞增殖能力和α-SMA蛋白表達水平則有所降低,證實GREM1可逆轉GFI1對LX-2細胞增殖能力和α-SMA蛋白表達的抑制作用,GFI1是通過負調控GREM1的表達抑制HSC增殖和活化。細胞外基質(ECM)的過度積累是肝纖維化的常見原因之一[21]。研究[22]發現GFI1可抑制多種黏附分子的表達并促進基質分離,這可能是GFI1抑制肝纖維化的其他作用機制之一。

綜上所述,GREM1在活化的HSC中高表達并促進HSC增殖及活化,GFI1則通過負調控GREM1的表達抑制HSC增殖和活化。本研究為肝纖維化的早期診斷和治療提供了新的生物標志物及治療靶點。但是GFI1和GREM1在動物模型中的作用及具體機制尚需深入研究。